细菌生物膜在临床中的研究进展

【摘要】  细菌生物膜是细菌在生长过程中附着于物体表面而形成的由细菌细胞及其分泌的含水聚合性基质(主要为胞外多糖)等所组成的膜样多细菌复合体。生物膜是细菌适应生存环境而形成的与游走态细胞相对应的存在形式，它具有很强的抵抗机体免疫和抗生素的能力，在临床上形成难治性感染。结合近年来的研究成果，介绍了生物膜的形成、基因调控、检测，讨论了其致病和耐药的机制以及防治等方面的问题。

【关键词】  细菌生物膜；慢性感染；综述

　　在临床上我们常发现一些患者，尤其是一些慢性病(如心内膜炎、尿路感染、慢性阻塞性肺部疾病等)及一些体内留置装置的患者，细菌感染后很难根除，即使实验室分离出致病菌，并找到敏感的抗生素应用于治疗仍起不到应有的疗效，经多年研究发现，这很多是由细菌生物膜(bacterial biofilm，BBF)引起的。生物膜广泛的存在于含水和潮湿的各种表面上，包括自来水管道、下水道、热交换系统甚至病理状态下的人体等，腐蚀管道，污染与人类生活相关的设施，造成很大的损失，也是医学感染的重要根源，据估计，大约65％的人类细菌性感染与BBF有关。因此，对BBF的研究日益受到人们的关注，在此我们就医学领域对BBF的研究进展综述如下。

　　1  细菌生物膜

　　1.1  细菌生物膜的概念  细菌生物膜是指细菌在生长过程中附着于物体表面而形成的由细菌细胞及其分泌的含水聚合性基质(主要为胞外多糖)等所组成的膜样多细菌复合体。细菌生物膜是细菌为适应环境而形成的特殊存在形式，它是与游走细胞相对应的存在形式，绝大多数细菌在进化过程中逐渐形成了精细的粘附机制，分泌基质并相互粘连形成膜状物附着于病灶表面，从而形成生物膜的复杂团体，并借信号分子相互交流以协调他们的行为，其生化组成为藻酸盐多糖和蛋白复合物，其基本结构由蘑菇样或柱样亚单位组成，亚单位分为头部、颈部、根部三部分，各部分之间形成水通道，完成各种运输功能，维持膜内细菌生存需要。

　　1．2  细菌生物膜的形成  自然界中，细菌生物膜可由单一菌种形成，也可由多菌种共同形成，只要条件适宜，任何细菌均可形成生物膜。不同菌种形成生物膜的能力不同，人体内一些条件致病菌，如铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希氏菌等更易形成生物膜。生物膜的形成过程大致分为以下几个阶段，粘附：浮游细菌接受环境信号通过自身的结构如鞭毛、纤毛等与周围组织或材料表面发生特异性结合，粘附其上；生长：细菌生长、分裂、繁殖，其他游走性细菌继续附着，同时细菌分泌胞外多糖(EPS)，形成微菌落；成熟：多个微菌落互相融合继续，形成彼此之间有液体通道相连的成熟的细菌生物膜；播散：成熟生物膜部分脱落或释放浮游细菌，这些浮游菌遇适宜表面继续附着、发展、成熟，形成循环往复，因此生物膜的形成是一个动态过程。

　　1．3  细菌生物膜的信息传递和基因调控  在生物膜内，细菌之间通过信号传递分子实现信息传递。国外学者研究证实， BBF成熟过程中，细菌的密度感应系统［1］(quorumsensing system)发挥着重要作用。如铜绿假单胞菌有 LasR-LasI及Rh1R-Rh1I信号系统，LasI基因产物调节胞外信号物质3-氧十二酰-L-高丝氨酸内酯(3OC12-HSL)的合成，细菌繁殖达到一定量，此物质便积累到阈值，即可启动LasR基因，该基因的产物反过来促进LasI基因表达3OC12-HSL。若此系统被破坏，则不能形成成熟生物膜，Rh1I产物诱导产生胞外信号 N-丁酰-L-同型丝氨酸内酯，而此胞外信号在Rh1R基因产物激活毒性基因、 RpoS基因的表达过程中是必须的［10］。革兰阴性细菌的密度感应系统大多是通过酰化高丝氨酸内酯(AHL)这一信号分子的浓度来调节群体的行为，它与细菌密度正相关，当达到阈值时可与一种转录激活子结合激活形成复合物诱导靶基因的表达。细菌密度感应系统是细菌通过监测其群体的细胞密度来调节其特定的基因表达，以保证BBF中营养物质的运输和废物的排出，避免细菌过度生长而造成空间和营养物质缺乏，使单个浮游的单核细胞统一步伐，像多细胞的真核细胞有机体那样有组织的共同对外界环境的刺激做出反应，增强了细菌群体的生存能力。环境因子亦能调节生物膜的形成。如表皮葡萄球菌的形成受环境中高渗(NaCl)或乙醇的影响［6］，NaCl通过 RsbU蛋白激活SigB，SigB进而激活icaADBC转录而促进生物膜形成。乙醇与其不同，乙醇抑制 icaR(icaADBC的阻遏蛋白)转录导致icaADBC转录增加促进生物膜形成。icaADBC控制多糖胞间粘附素(PIA)的形成，PIA是生物膜形成必需的。细菌生物膜中的细菌基因表达异于一般浮游菌，不同部分大约占到1％，如铜绿假单胞菌中一种噬菌体的基因高度表达，推测这种基因具有编码细菌毒素蛋白的功能。生物膜中另一种基因ropS表达被抑制，推测其影响膜的生态结构及对抗生素的敏感性［8］。

　　2  细菌生物膜的致病耐药机制

　　2．1  对抗机体免疫  生物膜对抗机体免疫的方式多样：不断释放抗原诱导产生特异性抗体，但胞外基质起着将细菌与机体免疫系统隔离开来的物理屏障作用，使特异性抗体、致敏性T细胞、吞噬细胞、自然杀伤细胞以及溶菌酶等对细菌的免疫攻击难以奏效，形成的免疫复合物诱导的炎症反应反而引起周围组织的损伤［2，3］；细菌生物膜产生的黏液多糖、藻酸盐抗体可抑制中性粒细胞和巨噬细胞的趋化和吞噬作用；可合成大量的毒性因子来抑制机体的免疫反应。铜绿假单胞菌产生的碱性蛋白酶和弹性蛋白酶可降低中性粒细胞的胞内杀菌作用；群体感应系统激活而使毒力骤然增强，容易抵抗机体免疫。

　　2．2  释放浮游菌  当机体内游走病原细菌被杀死后，生物膜内的细菌会由于自身调控脱落或环境冲刷作用释放细菌成为游走病原菌，形成新的生物膜，引起急性感染，如此反复发作。

　　2．3  多重耐药机制  形成BBF后，抗生素的作用位点消失或改变；启动抗生素外排泵，使菌体内抗生素蓄积减少，如铜绿假单胞菌至少有四种膜上主动泵出药物的系统共存［5］；BBF的渗透限制作用。生物膜内细菌分泌的胞外多聚物形成屏障阻止抗生素的渗透或降低抗生素进入胞内的浓度，从而降低疗效；分泌抗生素灭活酶。如铜绿假单胞菌可产生β-内酰胺酶，由于膜内细菌密度相对较大，因而β-内酰胺酶的浓度由于胞外基质的限制而呈现高浓度，可有效抵抗抗生素的作用；生物膜的不均质性。不少研究显示，膜外层细菌生长繁殖旺盛，而膜内细菌的生长代谢低下及营养供应受限，使细菌对抗生素不敏感或使一些作用于细菌生长期的抗生素失去作用；生物膜抗性基因及多药耐药泵(MDR pumps)基因的表达［9］；表面生长诱导 BBF产生特异性表型，如形成类似芽胞状态，对抗生素有高度抗性。

　　3  生物膜感染的实验室检查

　　在实验室中，对BBF的及时发现，以及筛选对BBF敏感的抗生素或抗生素组合对其防治至关重要，对一个慢性感染者，实验室用何种方法确定 BBF的存在，有待我们进一步研究发现，是测定生物膜细菌的信号传递分子如AHL等，还是测定相关基因，如tolA基因等，还是测定相关的胞外多糖，还是有其他方法，这些都有待我们进一步探索。Calgary生物膜装置(CBD)能快速、重复的进行细菌生物膜的抗生素敏感性筛选试验。可以在标准的96孔板上进行抗生素敏感性分析。临床上可用于 MIC法不能获得正确药敏结果而反复感染或院内感染细菌进行抗生素敏感性测定。 CBD是针对BBF合理选择抗生素以及评价抗生素复合物药效的重要技术［7］。

　　4  细菌生物膜的防治

　　由于BBF易形成于留置性医疗装置的表面，所以应尽量减少使用，不得不用也要缩短使用时间，另外可使用经过特殊处理的抗感染材料，试验证实，经处理的导管等新型材料可抑制BBF的生成［12］；寻找新型针对BBF的特异性抗生素，使其穿透BBF，消灭细菌，已发现了一种新的氟喹诺酮抗生素，可破坏生物膜。哌拉西林与妥布霉素或亚安培南与环丙沙星联合用药对铜绿假单胞菌生物膜有一定疗效；针对细菌群体感应系统，可采用抑制剂或拮抗剂，阻止细菌生物膜的分化成熟，已发呋喃酮与AHL结构相似，可竞争性的阻碍BBF的发育和成熟［4］。干扰生物膜形成过程中必需物质的合成的药物值得我们深入研究；物理方法如电流、超声震荡、激光等可预防BBF的生成，或提高抗生素对细菌的敏感性；新型抗感染微生态制剂［11］，可弥补传统抗生素易产生抗药性的缺陷；研发新型药物，使其可破坏裂解BBF，使膜内细菌暴露，从而可使抗生素与细菌直接接触，提高疗效。目前，细菌生物膜相关疾病发生率不断上升，且具有感染的难治性，我们的研究还只是开始，对BBF基因的表达、耐药机制、检测方法、措施等方面的研究还需进一步深入。相信不久的将来，人们对这一感染可以进行有效的控制。

【】
  　　［1］ De Kievit TR，Iglewski BH．Quorum sensing，gene expression，and Pseudomonas biofilms［J］.Methods Enzymo，1999，310：117?128.

　　［2］ Hoiby N.Pseudomonas aeruginosa and the in vitroand in vivo biofilm mode of growth［J］．Microbes Infect,2001,3:23.

　　［3］ Costerton JW． Bacterial biefilms．A common cause of persistent infections［J］．Science，1999，284：13?18．

　　［4］ Hentzer M．Inhibitionof quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa biofilm bacteria by a halogenated furanone compound［J］. Microbiology，2002,148:87.

　　［5］ 李新，王金良.细菌耐药性机制的研究进展［J］．国外医学临床生物化学与检验学分册，2001，22（5）：261?262.

　　［6］ Knobloch J K,Bartschte A. Bilfilm formation by Staphylococcus epidermidis depends on functional RsbU,an activator of the sigB operon:differential activation mechanisms due to ethanol and salt stress［J］. Journal of Bacteriology,2001,183(8):2624?2633.

　　［7］ 凌志强.快速测定细菌生物膜的抗生素敏感性筛选新技术［J］.国外医学流行病学传染病学分册，1999，26：227.

　　［8］ Whiteley M, Bangera MG, Bumgarner RE, et al. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms［J］. Nature,2001,413:860?864.

　　［9］ Brooun A, Liu S, Lewis K. A dose response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms［J］. Antimicrob Agents Che mother,2000,44:640?646.

　　［10］ 汪俊，刘正.生物膜分子遗传学研究［J］.国外医学口腔医学分册，2000，27（3）：135?137.

　　［11］ Potera C.Forging a link between biofilm and disease［J］. Science,1999,283:1837?1839.

　　［12］ Pascual A.Pathogenesis of catheter-related infections:Lessons for new designs［J］. Clin Microbiol Infect,2002,8:256.