影像实验研究中兔VX2 肝癌模型制作的完善及综合评价

                         作者：陈昆涛,何健垣,刘建民,郭瑞珍  

  【关键词】  VX2；肝癌；动物模型；综合评价

　　［摘要］ 目的：进一步完善兔VX2 肝癌模型的制作使之更适合影像实验研究，同时对其进行综合评价。方法:选新西兰大白兔90只作为实验动物，兔VX2瘤株动物自身传代保存瘤肿，采用瘤块注射种植法接种于兔肝左叶。将接种动物随机分为A组（30只）、B组（30只）和C组（30只），分别于接种后7天、14天、21天行CT、DSA及病观察。结果:种植成功率分别为A组７％（2/30）、B组９４％（28／３０）、C组８７％（26／３０）。CT扫描较小肿瘤大部分表现稍低密度，强化明显；较大肿瘤密度不均匀，强化不明显。DSA检查成功率９１％（５１／５６），均可见肿瘤染色。 结论:兔VX2 肝癌模型是较理想的影像实验研究肝癌模型，瘤块注射种植法操作简单，较，接种后14天的肿瘤较典型。

　　［关键词］ VX2；肝癌；动物模型；综合评价

　　Perfection In Making Rabbit Model Bearing VX2 Liver Tumor for Experimental Study of Imaging and Multiple Evaluation

　　Abstract： Objective To perfect the facture of rabbit model bearing VX2 liver  tumor for experimental study in imaging,  and evaluate the tumor show by performance of CT、DSA and pathology. Methods 90 New Zealand white rabbits.  the rabbits were injected with VX2 tumor pice in the left lobe of the liver. The 90 rabbits were divided into A group（n=30）、B group（n=30） and C group（n=30） randomly.CT、DSA and pathology were performed in rabbits after implantation 7days(A gyoup)、14days(B group) and 21days(C group). 　Results The successful  rate of implantation was 7％（2/30） in A group、94％（28／30）in B group  and 87％（26／30） in C group. The smaller tumors demonstrated themselves as low density on plain CT, conspicuous enhanced on arterial phase image, well discernible from the surrounding liver tissue. The bigger one revealed as heterogeneous hypodense mass with illdefined boundary in plain CT, unconspicuous enhanced on arterial phase image. The successful rate of DSA was 91%(51/56),and the tumors were  coloured on DSA.　Conclusion The rabbit model with VX2 liver tumor is suitable for experimental study of imaging. The inject implantation method is simple and economical. The tumor was typical in rabbits after implantation 14days.

　　Key words：VX2; Hepatoma; Animal model; Multiple evaluation

　　原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率较高。肝癌患者预后差的重要原因是由于多数患者未能早期诊断，以往肝癌模型大多是建立在鼠身上，不便于影像研究。兔VX2 肝癌模型是建立在较大动物身上的肝肿瘤模型，比较适合影像实验研究［1，2］。本实验对常用兔VX2 肝癌模型进行了一些改进，并分组进行CT、DSA及病理学评价，以评估肿瘤的生长变化及影像、病理特征，为筛选实验动物提供依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　动物及瘤株　实验兔90只，荷瘤兔2只，均选用新西兰大白兔，由中山大学动物实验部提供。VX2 肿瘤细胞株由中山大学动物实验部细胞库提供。

　　1.2　荷瘤兔制作　将肿瘤细胞接种于兔的双大腿皮下成瘤传代，20 d后观察瘤体直径约2 cm大小。

　　1.3　VX2 肝肿瘤模型的建立　25%乌拉坦4 ml/kg静脉麻醉荷瘤兔后，用外科方法完整取出肿瘤，剔除瘤周组织及包膜，剪取肿瘤边缘部分生长旺盛的鱼肉样组织为1 mm3 大小的瘤块备用。实验兔采用25%乌拉坦4 ml/kg静脉麻醉后仰卧位固定，常规腹部备毛，常规消毒铺巾,于兔左侧肋缘下横切开口，暴露出肝左叶，采用18号穿刺套管针装好肿瘤组织块后穿刺进入肝左叶,进针深度约1.5 cm ,将瘤组织块缓慢注入肝实质，拔针时用棉签压迫针道约3 min,逐层缝合腹膜、肌肉及皮肤。术后3 d给予青霉素预防感染，动物房温度保持在24 ℃左右，湿度在60%左右，注意通风。

　　1.4　CT扫描　将90只接种后动物随机分成3组（7 d、14 d、21 d），每组30只。每组于相应时间作CT三期扫描，CT机为西门子SOMATOM Emotion Duo双层螺旋CT机。扫描参数：电流200 mA，层厚3 mm，层距3 mm，FOV 20 cm。造影剂选用优维显（Ultravist,300 mg/ml）,量为２ ml／kg，采用高压注射器，注射速度为0.5 ml/s。

　　1.5　DSA　在CT扫描后随即进行，选用2F导管经股动脉切开插管行肝动脉造影，股动脉插管失败者行开腹肝动脉插管造影。

　　1.6　病理学观察　每只动物DSA检查完后即处死，先进行大体观察（有无肿瘤、腹腔积液、淋巴结转移及肿瘤大小、形状、颜色、质地等），然后切取癌灶及其周围肝组织，用10%甲醛液固定24 h后石蜡包埋，切片，HE染色后在光镜下观察组织病理学改变。

　　2　结果

　　2.1　CT评价　A组30只实验兔中只有2只发现肿瘤，约0.5 cm大小，平扫表现为稍低密度结节，增强扫描动脉期强化明显（见图1）。
　　
　　呈快进快出强化特征。B组：28只存活兔均发现肿瘤，大小为1.2 cm～2.5 cm，平扫主要表现为稍低密度结节（见图2）。
　　
　　增强扫描动脉期大部分明显强化（CT值增加30 Hu以上），其中3例肿瘤中心有不强化低密度坏死区。C组：26只存活兔均发现肿瘤，肿瘤最大直径最小的为3.1 cm,最大的为4.5 cm，平均3.8 cm，平扫为不均匀低密度肿块，增强扫描呈不均匀强化，其中24例中心有不强化低密度坏死区（见图3）。

　　图1　A组兔CT增强扫描动脉期：肝左叶见一约0.5 cm大小明显强化结节(略)

　　图2　B组兔CT平扫：肝左叶见一约1.3 cm大小低密度结节(略)
 
　　图3　C组兔CT增强扫描门脉期：肝左叶见一约4.5 cm×3.1 cm大小低密度肿块，部分液化，未液化部分强化不如正常肝实质(略)

　　表1　存活兔肿瘤CT扫描比较表(略)

　　注：两组间采用Fisher精确概率单侧检验，A组与B、C组间肿瘤发现率及肿瘤大小的比较均有统计学意义（P＜0.01）;B、C两组间动脉期明显强化率及坏死出现率的比较也有统计学意义（P＜0.01）。

　　2.2　DSA检查　A组2例未见明确肿瘤血管，B组28例中25例、C组26例中24例经股动脉插管造影成功（成功率91%），其它5例股动脉插管失败而成功行开腹肝动脉插管造影检查，均有明显肿瘤染色（见图4）。

　　图4　DSA检查：左肝动脉相对较粗大，肝左叶见肿瘤染色(略)
 
　　2.3　病观察　大体观察：A组CT发现肿瘤2例在肝左叶仔细触摸后发现结节，肝表面未见明显异常，切面观察肿瘤呈灰白色，与正常肝组织分界清楚，中心无坏死。HE染色镜下观察：肿瘤细胞呈巢状弥漫分布，肿瘤细胞多为梭形、圆形，胞浆较少，核大而深染，间质较少（见图5）。

　　图5　病理切片HE染色镜下（×200）观察：肿瘤细胞呈巢状弥漫分布，细胞呈梭形、圆形，核大而深染，间质很少(略)
　　
　　B组：21例肝表面可见结节状突起，其余7例用手容易触摸到结节，肿瘤外观多呈灰白色，切面观大多呈灰红色、鱼肉样；12例与正常肝组织分界不清，3例中心有坏死。C组26例均可见肿瘤，较大者突向肝外生长（见图6）。

　　图6　病理标本大体观察：肝左叶见一约4.5 cm×3.6 cm×3 cm大小不规则肿块，表面呈灰白色(略)
　　
　　24例中央有坏死；2例有腹水及局部粘连。

　　3　讨论

　　3.1　兔肝癌模型制作　以往的肝癌模型大多是建立在鼠的身上，但是由于鼠身体较小，血管较细，一般影像技术难于显示，也不便于实验中血管性操作。本课题在筛选实验动物时曾试用过大鼠，但因经尾静脉注射造影剂及肝动脉插管成功率非常低而放弃，而兔身体较大，血管相对较粗。本组用高压注射器经耳缘静脉注射造影剂成功率100%，经股动脉插管血管造影成功率91%。 VX2肿瘤是广泛认可的兔可移植性肿瘤，由shop病毒在野兔皮肤诱发的鳞癌经数十次传代而建立［2］。动物自身多次传代的肿瘤会较早出现坏死且坏死明显，其恶性程度明显增加［3］。肝癌模型常用的制作方法主要有诱导、种植等。诱导造模所需时间较长，并且不便于控制，而种植造模时间较短，容易控制。采用肿瘤细胞或悬液直接注射种植成功率较高，但操作较繁锁，有的学者采用包埋法，种植过程中要注意止血，使用明胶海绵或生物胶［4，5］。兔的肝脏左叶体积较大，因此我们采用兔腿部接种成瘤传代作为瘤种，用瘤块注射种植于兔肝左叶，成功率为90%（B、C两组检查时存活的54只兔均种植成功；A组由于种植时间较短，未统计成功率）。为了提高种植成功率和肿瘤的生长质量，在模型制作过程中我们体会到除要注意无菌操作、预防感染及动物室的环境外，还要注意以下几点：种植在肝左叶组织最厚处；斜行进针，减少瘤块逆流；注入瘤块时要缓慢，不能加压快速推注；迅速拔针；用棉签压迫针道时间要足够，确认无出血后方能关腹；不要使用明胶海绵，以避免致敏反应；瘤块要在肿瘤边缘部剪取。

　　3.2　影像学评价　本组CT平扫肿瘤密度均低于正常肝实质，增强扫描动脉期大部分肿瘤强化明显（CT值增加30 Hu以上），较大、有坏死肿瘤强化不明显，但DSA均见肿瘤血供丰富，染色明显，这说明肿瘤富血供。我们认为部分肿瘤强化不明显的原因:肝动脉较小，血流量较少；肝动脉门静脉短路所致。 A组与B、C组间肿瘤发现率及肿瘤大小的比较，B、C两组间动脉期明显强化率及坏死出现率的比较均有统计学意义（P＜0.01）。这说明A组由于种植时间短，影像检查难于发现；而C组肿瘤大部分发生坏死，均不利于典型肝癌的影像研究。由于兔的血管相对较粗大，本组经股动脉插管成功率为91%，DSA可清晰地显示肿瘤血供及染色，可更直观的显示肿瘤的分布，对有极大的价值［6］。

　　3.3　病理学评价　肿瘤外观多呈灰白色，切面观大多呈灰红色、鱼肉样。A组肿瘤较小，质地均匀，界限清楚，B组大部分肿瘤质地尚均匀，少数（3例）有液化坏死，边界欠清楚，说明肿瘤以膨胀浸润方式生长。C组肿瘤大部分发生液化坏死。综上所述，兔VX2 肝癌模型肿瘤呈膨胀性浸润性生长，血供丰富，具有与人类肝细胞癌极为相似的病理学及影像学特征；血管操作成功率高，是较理想的用于影像实验研究的肝癌模型。瘤块注射种植法操作简单，较、容易控制、成功率高，是一种较好的造模方法。种植后14 d影像检查容易发现肿瘤，并且较典型，最适合于影像研究。

　　参考:

　　［1］　Mugitani T, Taniguchi H, Takada A,et al.TNP470 inhibits collateralization to complement the antitumor effect of hepatic artery ligation［J］. Br J Cancer, 1998,77:638.

　　［2］　王迎选，杨立，田嘉禾，等。兔VX2 肝癌肝动脉插管栓塞术［J］.中华放射学杂志，1992，26：716.

　　［3］　Shope RE, Hurst EW. Infectious papillomatosis of rabbits: with a note on the histopathology［J］. J Exp Med, 1933, 58: 607624.

　　［4］　邵国良, 周康荣, 王建华, 等. 介入治疗实验研究中兔VX2肝癌模型制作的改进CT评价［J］. 临床放射学杂志, 2000, 19(10): 653654.

　　［5］　柳曦, 李欣, 赵俊功, 等. 兔VX2肝癌模型制作及综合影像评价［J］. 实用放射学杂志, 2002, 18(2): 132134.

　　［6］　吴红英, 冯敢生, 梁惠民, 等. DSA技术在兔肝脏介入实验中的应用研究［J］. 临床放射学杂志, 2005, 24(1): 8485.