酶免疫分析法检测肝肾胰岛细胞移植患者术后CSA浓度的临床评价

               作者：温冬梅，梁剑平，吴剑杨，庞嘉琳，李曼 

【关键词】  酶免疫分析法；移植；环孢霉素药物浓度

　　［摘要］ 目的：评价用酶免疫分析法检测环孢霉素药物浓度进行药物浓度监测(TDM)的可靠性，测器官移植患者全血中环孢霉素的药物浓度，确保实体器官移植受体得到最有效的免疫。方法：根据美国国家试验室标准委员会(NCCLS)EP5A、EP9A文件要求进行方法精密度、准确度、线性、回收率、携带污染率的评价试验，并对我院7例肝移植患者、21例肾移植患者、3例胰岛细胞移植患者进行342次全血环孢霉素药物浓度测定。结果：该方法的批内和批间平均变异系数分别为1.815％和2.935％，线性回归方程为其平均回收率为98.8％，Y=1.019　3X-0.195　6，r=0.999　9，样本携带污染率低，肝肾移植患者术后应用三联免疫抑制疗法，环孢霉素药物浓度平均浓度为265 ng／ml，患者无排斥反应和药物中毒反应。结论：酶免疫分析法测定环孢霉素药物浓度具有快速、准确、灵敏度高、操作简便、适于批量测定等优点，适合于器官移植患者术后的临床药物浓度监测，可广泛推广使用。

　　［关键词］ 　酶免疫分析法；移植；环孢霉素药物浓度

　　环孢霉素A(CSA)是真菌源性环状十一氨基酸多肽，是一种作用很强而选择性很高的免疫抑制剂［1］，临床上主要用于器官移植以及免疫发病机制介导疾病的治疗，为目前公认的抗器官移植排斥反应最为有效的药物。监测患者全血中环孢霉素的药物浓度，并联合患者的临床情况和其他实验室数据后对其进行解释，从而确保实体器官移植受体得到最有效的免疫治疗和降低药物毒性是至关重要的，可以有效地维护患者的最佳免疫抑制水平。我科于2004年7月至2006年4月采用酶免疫分析法对我院7例肝移植患者、21例肾移植患者、3例胰岛细胞移植患者进行342次全血环孢霉素药物浓度测定，以评价该方法的实用性和探讨其临床价值，现报告如下。

　　1　材料及方法

　　1.1　仪器　DADE Dimenion RXL全自动生化分析仪。

　　1.2　试剂　杜邦原装配套Flex试剂船，含底物稀释液、前处理试剂和β牛乳糖CSA酶标记抗体、固定于二氧化铬颗粒上的CSA、CPRG底物和用于水解的药片、酶标记抗体等试剂。

　　1.3　方法和结果

　　1.3.1　测定原理　采用免疫分析技术，通过磁性颗粒分离出游离和与CSA结合的酶抗体样品，测定时使用的Flex试剂船，系统自动混合并溶解全血样品，再与酶标抗体试剂混合，样品中存在的CSA与酶标抗CSA抗体试剂结合，将包被有CSA的磁粉颗粒填加到结合与游离的抗体酶标结合物溶液中，然后通过磁作用将反应混合物分离。分离后，含有CSA抗体酶复合物的悬浮液被转移致电其他比色杯中，与底物β牛乳糖混合后，催化CRPG水解成CPR，在577 nm处有最大的吸收峰，由于CPR的形成而产生的577 nm处吸光度的变化与患者样品中的CSA含量呈比例，可以采用双波长577 nm，700 nm速率技术进行测定。

　　1.3.2　样品的收集和保存　按照常规的步骤采集EDTA抗凝全血样品，在2 ℃～8 ℃下保存可以储存7 d,样品置于-20 ℃条件下冷冻可长期储存。

　　1.3.3　样本携带污染率测定　参照ICSH推荐的方法［2］，将高值标本连续测定3次，接着连续测定低值标本3次，携带污染率公式为(L1L3)／(H1L3)×100％，其中L1、L3分别为低值第1次和第3次测定值，H3为高值第3次测定值，检测CSA的携带污染率为0.22％＜1％，接近于0.00，说明仪器具有良好的冲洗功能，交叉污染率低。结果见表1。

　　表1　样本携带污染率（略）

　　1.3.4　准确度评价试验　准确度评价试验［3］根据美国国家试验室标准委员会(NCCLS)EP9A文件要求，做方法学比较试验。每天收集8份标本，分别用酶免疫分析法和HPLC(高效液相色谱法)测定，连续测定5 d，共计80份标本，以酶免疫分析法测定结果为Y轴，对比方法高效液相色谱法为X轴，进行回归分析和卡方检验。该方法与高效液相色谱法进行方法学比较，两法差异无显著性(P>0.05)，直线回归方程为：Y=1.071X+0.061 3，r=0.978，提示两法相关性良好，符合临床实验要求。

　　1.3.5　线性评价［3］　从本院肾移植术后患者中收集高CSA的全血，混合后为高值标本，用生理盐水做5个浓度的稀释，在本仪器上检测作得的检测值为实测值，根据稀释浓度可以出5个样本的CSA浓度为预期值。以预期值作横坐标，实测值作纵坐标，做直线回归分析，观察其线性。检测限和线性关系：相关方程Y=1.019 3X-0.195 6，r=0.999　9，其中b=1.019 3，a=-0.195 6，b接近1，a接近0，r>0.95，符合临床试验要求。结果见表2。

　　表2　线性范围评价结果（略）

　　1.3.6　回收率　分别将CSA浓度为69 ng／mL、254 ng／mL、568 ng／mL的全血质控品加入到全血样品中，测定回收率，平均回收率为98.8％，结果见表3。

　　表3　回收率（略）

　　1.3.7　仪器精密度评价　精密度评价试验［3］根据美国国家试验室标准委员会(NCCLS)EP5A文件要求，做精密度评价试验。选择具有医学决定水平的CSA浓度为568 ng/ml、69 ng/ml的高、低浓度的全血质控品连续测定20次，计算出均值、标准差和CV值为批内精密度；每天取高、低值2个浓度的全血质控品测定CSA 2次(2次测定间隔>2 h)，共测定20 d，计算出均值、标准差和CV值为批间精密度。该方法的批内和批间平均CV分别为1.815％和2.935％，该方法符合要求。结果见表4和表5。

　　表4　批内重复性试验结果（略）

　　表5　批间重复性试验结果（略）

　　1.3.8　临床应用　确定酶免疫分析法测定CSA后，应用此法对2004年7月至2006年4月对我院7例肝移植患者、21例肾移植患者进行342次全血环孢霉素药物浓度测定，同时进行肝肾功能、尿常规、CD4、CD8检测，以综合评价CSA监测结果的临床价值，患者术后采用标准三联免疫抑制疗法，肝肾移植患者CSA血药浓度监测结果在有效范围内的256例，占74.9，高于有效血药浓度上限的20例占5.8%，低于有效血药浓度下限的66例占19%，高于有效血药浓度上限患者多伴有肝肾功能异常及临床体征，经及时调整剂量，都在全血治疗浓度范围内，获得良好临床疗效。

　　2　讨论

　　2.1　CSA的免疫抑制作用　CSA能选择性地抑制T淋巴细胞产生生长因子，是一种作用很强而选择性很高的免疫抑制剂，能有效地预防心、肺、肾、肝、胰腺等器官移植术后的排斥反应，主要用于器官移植以及免疫发病机制介导疾病的治疗，为目前公认的抗器官移植排斥反应最为有效的药物。CSA虽较其他免疫抑制剂毒性作用少，但环孢霉素用量不够时会导致免疫系统对移植器官的排斥反应，环孢霉素过量会导致许多严重的副作用，它吸收和代谢的个体差异存在，有效治疗剂量范围小，环孢素A的剂量、血药浓度与疗效、药物毒性密切相关，而浓度更直接地反映抗排斥应的量效关系和量毒关系，因此监测患者全血中CSA的药物浓度，并联合患者的临床情况和其他实验室数据后对其进行解释，从而确保实体器官移植受体得到最有效的免疫治疗是至关重要的，可以有效地维护患者的最佳免疫抑制水平。

　　2.2　温度效应　CSA和蛋白质的结合率以及红细胞对CSA的摄取可受温度的影响，因此在不同温度下分离血浆或血清测得CSA的结果相差很大，Britton等研究表明，全血与血浆或血清相比有相对稳定的CSA浓度，并且可以排除温度效应，故本法采用全血作为测定CSA的标本，采血后如不能及时测定应在2 ℃～8 ℃下可以保存7 d。

　　2.3　影响CSA血药浓度监测值的因素　患者服药后其血药浓度在12 h内经过一个最高峰到达峰谷，因此服药时间和采血时间的正确与否直接影响到CSA的血药浓度监测值，CSA的服药方法为q12 h，血药浓度监测点为Cmin与Cmax，因此正确的的采血时间应在服药前及服药后的2 h［4］，以测定稳态谷浓度，如怀疑过量中毒时可随时取血。

　　2.4　全血CSA谷值浓度的监测　不仅对排斥反应及中毒有重要的鉴别意义，而且在指导临床用药方面有实际意义［5］，CSA的全血治疗范围为100 ng/ml～400 ng／ml，最小中毒浓度参考值为600 ng／ml［6］，这两项指标因人而异，要结合临床症状判定。CSA可以静脉注射，亦可以口服给药，在治疗过程中其生物利用度增加，为了保持其稳定血药浓度，口服给药时应逐渐减量。CSA的浓度监测有助于调整剂量，以避免剂量不足而治疗无效或过量而中毒。

　　2.5　CSA血药浓度的测定方法　目前国内外测定CSA血药浓度的方法有放射免疫法(RIA)、荧光偏振免疫法(FPIA)和高效液相色谱法(HPLC)等，RIA法易受代谢物影响而发生交叉反应造成干扰，故其结果高于HPLC法，甚至可高出数倍；虽然FPIA检测灵敏度较高，但其检测特异性及准确性差；HPLC法特异性、灵敏度和重复性均好，但色谱条件要求高，要求对样品进行预处理，耗时，较难普及推广。酶免疫分析法测定CSA浓度在全自动分析仪上进行，采用高科技的“磁粉免疫分离技术”，多相免疫(酶标法)与比色法结合在一起进行检测。测定时使用的是专机专用的Flex试剂船，独特的Flex试剂系统提供更高的检测稳定性、准确性及方便性。在本文中，对酶免疫分析法进行了方法学评价，并对我院7例肝移植患者、21例肾移植患者、2例胰岛细胞移植患者进行342次全血CSA药物浓度测定，研究结果表明，该方法测定CSA快速，简便，全血标本不需手工进行前处理，检测一样品只需20 min，准确性、重复性好、精密度高，与HPLC法有良好的相关性，样本携带污染率低，且通过对肝、肾、胰岛移植术后患者CSA浓度测定结果显示，与肝、肾、胰岛移植术后患者临床疗效与毒副反应有良好相关性。对临床监测肝肾胰岛细胞移植患者CSA药物浓度治疗的安全性与有效性有很重要的临床意义。

　　参考：

　　［1］　汤光.药物学［M］.北京：医药科技出版社，1997：813814.

　　［2］　England JM，et al.Guidelines for evaluation of blood cell analyzers including those used for differential leucocyte and rericulocyte counting and cell marker applications［J］．Clin Lab Hematol,1994,16：157174.

　　［3］　杨昌国，许叶．线性评价和干扰试验中NCCLS评价方案的应用［J］．临床检验杂志，1999，17(3)：4749．

　　［4］　陈萍.环孢霉素A的血药浓度探讨［J］.中国热带医学，2003：3(2).

　　［5］　Kahan Bd．环孢霉素的药效动力学及药物动力学［J］.中国器官移植杂志，1990，11(1)：126．

　　［6］　康格非.临床生物化学和生物化学检验［M］.第2版.北京：人民卫生出版社，1999：225.