复方中药“克瘤宁”对人食管癌的抗癌作用及其机理研究
【关键词】 克瘤宁/药
摘 要：目的：探讨复方中药“克瘤宁”对人食管癌的抗癌作用及其机理。方法：① 应用光镜、透射电镜，观察复方中药“克瘤宁”诱导人食管癌细胞株EC109细胞凋亡的作用；② 用“克瘤宁”对移植人食管癌8d后的裸鼠进行，实验共分五组：“克瘤宁”高浓度组（2.4g/kg）、中浓度组（1.2g/kg）、低浓度组（0.6g/kg）、阳性对照组（平阳霉素15mg/kg）和阴性对照组（生理盐水）。“克瘤宁”灌胃给药，每天一次，连续给药36次，平阳霉素腹腔注射给药，每3d一次，共给药12次。实验重复二次。结果：① 经“克瘤宁”处理的EC109细胞出现典型的细胞凋亡特征；② 克瘤宁高、中、低三剂量在裸鼠体内对食管癌的抑瘤率分别为：66.36%～76.85%(P<0.01)、54.21%～55.56%(P<0.01)、38.32%～39.81%(P<0.01)，阳性对照平阳霉素在裸鼠体内对食管癌的抑瘤率为51.40%～56.48%(P<0.01)。结论：① “克瘤宁”有诱导人食管癌细胞产生凋亡的作用，这可能是“克瘤宁”抗食管癌作用的重要机理；② 在裸鼠可耐受的剂量下，“克瘤宁”对裸鼠移植的人食管癌有明显抗癌作用，且随着剂量增加，其抗癌疗效增加。
关键词： 克瘤宁/药理学； 食管肿瘤/中药疗法； 动物疾病模型； 裸 鼠
Antitumor Effect of Zhenhuang Capsule on Human Esophageal Carcinoma and its Mechanisms
Abstract： Objective： To investigate the antitumor effect of Zhenhuang capsule(ZHC) on human esophageal carcinoma and research its mechanisms. Methods： ①Apoptosis induced by ZHC in human esophageal carcinoma cell line EC109 was investigated by light microscopy, transmission electron microscopy combined with flow cytometry analysis technique. ② A perfusing test with ZHC was conducted on nude mice 8 days after the human esophageal carcinoma transplantation. The animals were divided into 5 groups: high ZHC dose group (2.4g/kg, BW), medium ZHC dose group (1.2g/kg), low ZHC dose group (0.6g/kg), positive control group of Pingyangmycin (15mg/kg) and saline control group. ZHC was perfused into stomach, once daily, with 36 times consitituting one course. Pingyangmycin was injected intraperitaneously, once every three days, 12 times consitituting one course. The test was repeated 2 times.Results： ①After exposure to ZHC, EC109 cells manifested typical apoptotic features. ②The tumor-inhibiting rates of the high, medium and low dose ZHC groups ranged from 66.36% to 76.85%(p<0.01), 54.21% to 55.56%(p<0.01) and 38.32% to 39.81%(p<0.01), respectively. The tumor-inhibiting rate of the Pingyangmycin group ranged from 51.40% to 56.48%(p<0.01). Conclusion： ①ZHC induces apoptosis of esophageal carcinoma cells and ZHC induced apoptotsis possibly the primary mechanism of ZHC for treatment of esophageal carcinoma. ② ZHC has significant antitumor effect on human esophageal carcinoma transplanted into nude mice receiving tolerance doses. The effect increase with elevation of dose.
Key words： Zhenhuang capsule/pharmacodynamics； Esophagus neoplasms / TCD therapy； Animal disease models； Nude mice
本实验通过体外培养和裸鼠体内实验两途径，研究“克瘤宁”对人食管癌的抗癌作用，旨在从细胞凋亡的角度探讨“克瘤宁”治疗食管癌的作用机理。
1 材料和方法
1.1 细胞株：人食管癌细胞株EC109，取材于河南省林州食管癌病人手术标本，建株于1975年。
1.2 药物：“克瘤宁”（复方中药），由汕头大学医学院第二附属黄新苏医生研制。平阳霉素，天津河北制药厂生产，批号：19990310。
1.3 试剂和仪器：细胞培养基PRMI-1640（BIBCO-BRL公司产品），小牛血清（广州三源生物制品公司产品），MTT（四甲基偶氮唑）（Sigma公司产品），DMSO（二甲基亚砜）（日本）。倒置相差显微镜，Olympus/BM-6显微镜（日本），酶标仪（DG3022A），透射显微镜（Philips EM-410），流式细胞仪（Coulter，Elite-ESP），CO2培养箱（Revco美国）。
1.4 实验动物：BALB/C nu/nu裸鼠，鼠龄6周～8周，体重18g～23g，由厦门大学抗癌中心裸鼠室提供（动物合格证号：闽实动质准第009号，SPF级），动物饲养在SPF环境下（动物实验设施合格证号，粤医动字第26-004号，SPF级），裸鼠所需的物品、饮水、标准饲料均须经高压蒸汽消毒后方可使用。
1.5 实验方法
1.5.1 细胞毒性实验：在96孔培养板上常规接种细胞，每孔接种细胞数为2×105。药物分5个剂量组，浓度按K值为0.66等比稀释，最高剂量为80ug/ml。每剂量设三个平行孔，同时设空白对照组。培养24h后，加入不同浓度的“克瘤宁”提取液（由“克瘤宁”复方提取而成），继续培养96h，培养结束前4h加入浓度为0.5mg/ml的MTT100ul（用无血清的RPMI1640培养液稀释）继续培养4h。弃去培养液，加DMSO 100ul溶解沉淀物，振荡后在酶标仪上测量吸光度值（波长为570nm），按公式：细胞生长抑制率（%）=（对照组吸光度-实验组吸光度）/对照组吸光度。各剂量组细胞生长抑制率，求出IC50。
1.5.2 光学显微镜观察细胞凋亡：根据细胞毒性实验结果，经40ug/ml药物处理24h后的细胞及对照组细胞，常规HE染色，在光学显微镜下观察细胞形态变化。
1.5.3 电镜观察细胞凋亡：取经离心后收集的细胞，用PBS液洗2次，计数5×106个细胞，用2.5%茂二醛溶液固定细胞45min，再用1% OsO4固定1h，脱水，并用618树脂包埋2h后，作超薄切片，经常规染色后进行电镜观察。
1.5.4 裸鼠体内实验：用我们建立的人食管鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型(Eca910709)第52代移植瘤做瘤源。取新鲜癌组织2mm×2mm×2mm置含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液中备用,接种于裸鼠背部皮下同一部位,每鼠接种一块。移植成功率100%。。待移植瘤长至d8，约3mm直径时，将动物随机分为五组，然后开始治疗。“克瘤宁”高浓度组、中浓度组、低浓度组：分别按2.4g/kg、1.2g/kg、0.6g/kg灌胃给药，每天一次，每次0.2ml,共36次；阳性对照（平阳霉素组）：按15mg/kg腹腔注射给药，每3d一次，每次0.2ml,共12次；阴性对照组：给生理盐水灌胃，每天一次，每次0.2ml,共36次。末次给药后24h，处死动物,剥瘤称重。实验数据统计学处理采用t检验。重复实验均按上述方法进行。
2 结果
2.1 在培养过程中经不同浓度珍黄注射液处理的EC109细胞，其生长抑制率与药物浓度相关，呈现出明确的量效关系，24h、48h、72h测得的IC50值分别为40.4ug/ml、35.1ug/ml、32.6ug/ml（表1）。
表1 “克瘤宁”提取液对人食管癌细胞EC109的细胞毒性作用（略）
2.2 经“克瘤宁”提取液处理后培养的EC109细胞形态显示有较明显的凋亡特征。与未经药物处理的EC109细胞比较，光学显微镜下表现为核染色质发生凝集，断裂，边移，呈致密深染的块状，胞膜完整，但表面不规则，形成牙状突起。
2.3 电镜下观察，亦可看到核染色质凝集，断裂成块状，附着于核膜内面，核膜完整，胞浆致密，胞浆内有空泡样结构，内质网轻度肿胀。对照组EC109细胞形态无上述改变。
2.4 “克瘤宁”对裸鼠移植的人食管癌的抗癌作用: 实验采用人食管鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型（Eca9110709）。组肿瘤较对照组明显缩小,尤以“克瘤宁”高浓度组最为明显。在2.4k/kg、1.2k/kg、0.6g/kg剂量下，“克瘤宁”对食管癌的抑瘤率分别为：66.36%～76.85%、54.21%～55.56%、38.32%～39.81%。分别与阴性对照组比较均有非常显著性意义（P<0.01）,而阳性对照平阳霉素在15mk/kg剂量下，对食管癌的抑瘤率为51.40%～56.48%（与阴性对照组比较P<0.01）。说明“克瘤宁”对裸鼠移植的人食管癌有显著的抗癌作用，且随着剂量增加，抗癌疗效增加（表2）。
3 讨论
凋亡（apoptosis）或称程序性细胞死亡（programmed cell death）是具有特殊形态学和生化改变的一种细胞死亡形式。细胞凋亡与肿瘤发生和抑制有密切关系。目前检测凋亡的手段较多，主要包括形态学观察、细胞DNA电泳、染色体断片识别及流式细胞检测等。在形态学方面，典型的细胞凋亡过程在超微结构上表现为细胞核固缩，染色质块集皱缩核膜下，核碎裂，凋亡小体形成［1］。本文也进行了电镜观察，结果发现经药物作用后，一些EC109细胞，其细胞核染色质凝集，断裂成块状，附着于核膜内面，核膜完整，胞浆致密，胞浆内有空泡样结构，内质网轻度肿胀，这是凋亡细胞的形态变化。流式细胞术检测已成为凋亡的一种常规检测手段［2］，其最常用的方法是检测DNA含量改变。本实验用此方法很好的检测到经“克瘤宁”提取液处理的癌细胞出现凋亡峰。
表2 “克瘤宁”对裸鼠移植的人食管癌的抗癌作用（略）
越来越多的研究表明，许多化疗药物能诱导肿瘤细胞凋亡，诱导细胞凋亡可能是化疗药物抑制肿瘤的主要机理之一［3，4］。某些中药单味药也能诱导肿瘤细胞凋亡。陈国强等通过对三氧化二砷（砒霜）杀伤急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4细胞的机理研究，证实三氧化二砷能诱导NB4细胞凋亡［5］。沈忠英等证明砒霜也能诱导人食管癌细胞凋亡［6］，但复方中药，诱导肿瘤细胞凋亡的报道尚少。本实验以人食管癌细胞株EC109细胞为靶细胞，观察“克瘤宁”诱导人食管癌细胞凋亡的作用，证实经“克瘤宁”处理的人食管癌细胞株EC109，其细胞抑制率与药物浓度相关，呈现出明显的量效关系，同时形态学检测，也证明本药在体外有诱导人食管癌细胞EC109产生凋亡的作用，这可能是“克瘤宁”抗食管癌作用的重要机理。
人癌裸鼠移植瘤模型是人体外动物体内高度接近人类肿瘤的动物模型，用此类模型进行药物敏感性试验，已有大量研究报道［7］，通过与临床反应比较，认为人癌裸鼠移植瘤模型对抗癌药物的反应性与临床反应基本平行［8，9］，本实验采用的人食管癌裸鼠移植瘤模型，是作者用外科手术切除的食管癌组织直接移植于裸鼠而建立的，经长期传代，其生物学特性仍稳定，且保留对平阳霉素等抗癌药物的敏感性。用此模型进行的实验性治疗研究，可获得可靠的结论。本研究证实，在裸鼠体内，“克瘤宁”对裸鼠移植的人食管癌有明显抗癌作用，且呈有的量效关系。
抗癌药物能否在体内诱导人实体瘤细胞发生凋亡，是目前肿瘤治疗中令人关注的问题。童彤等证实，铂类抗癌药不但可以在体外诱导人白血病细胞HL-60发生凋亡，同样可以在体内诱导人卵巢癌细胞发生凋亡［10］。在食管癌方面，体外诱导人食管癌细胞凋亡已有较多报道［12，13］，而在体内诱导其凋亡的报道尚少见［14］。本研究仅仅证明“克瘤宁”能在体外诱导人食管癌细胞凋亡，而在体内是否亦有此作用，尚有待进一步的研究。
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