人牙髓细胞DPDP

【关键词】  牙髓/细胞学；牙龈；成纤维细胞；基因文库；序列分析；BLAST分析

　　Sequence analysis of DPDP2 gene cloned from human dental pulp cells

　　【Abstract】 AIM: To study the function of DPDP2, a new gene cloned from human dental pulp cell (HDPC). METHODS: A modified PCRbased subtractive hybridization technique was used to establish a subtractive cDNA library. Genes differentially expressed in HPDC and human gingival fibroblasts (HGF) were cloned and sequenced. A new gene named DPDP2 was cloned and structural and functional analyses were   performed by PC/GENE 6.60 software. RESULTS: The fragment of DPDP2 cloned from the present subtractive cDNA library was 810 bp, containing an incomplete coding region. However, after splicing with an EST sequence named KIAA0265, a 6172 bp complete cDNA sequence was achieved which encodes a 83aa hydrophobic protein with a secondary structure characterized by a helical conformation, an extended conformation and a coil conformation. The secondary structures could assemble a threedimensional structure through folding of α, β or α/β sheets. Antigen epitope analysis implied three possible antigenic determinants:GluAsnLysArgThrGly, LeuIleGluArgLeuLys and GluLeuAlaTrpGluLys. A transmembrane helical structure and a mitochondria transportation structure were also found. Signal peptide analysis further indicated that DPDP2 was a nonsecretory protein. No homogeneous protein was found in Nonredundant SwissProt sequences and PDB protein database. CONCLUSION: DPDP2 encodes a transmembrane protein that has both signal transduction structural features and  CKII phosphorylation site, indicating its possible functional relationship with cell mitosis and transcription.

　　【Keywords】 dental pulp/cytology; gingiva;  fibroblasts; gene library;  sequence analysis; BLAST analysis

　　【摘要】 目的： 在人牙髓细胞中克隆DPDP2基因，研究其可能的功能. 方法： 体外培养HDPC和人牙龈成纤维细胞（HGF），应用基于PCR的改良消减杂交技术构建HDPC和HGF cDNA消减文库，批量克隆HDPC和HGF的差异表达基因并测序，使用GenBank的BLAST对测序结果进行同源序列比较，并运用机软件PC/GENE 6.60版对筛选到的DPDP2基因进行结构和功能分析. 结果： DPDP2基因序列全长810 bp，没有一个完整的编码区. 可与KIAA0265 gene拼接成一个长6172 bp的完整序列，编码一个含有83个氨基酸的疏水性蛋白，其二级结构由螺旋结构、卷曲结构和伸展部分所组成. 它们可以通过α, β或α/β折叠而形成三级结构. 抗原表位分析发现它可能有3种抗原决定簇结构，即GluAsnLysArgThrGly, LeuIleGluArgLeuLys和GluLeuAlaTrpGluLys. 该蛋白存在一种跨膜螺旋结构和线粒体运输肽结构. 进一步的分泌信号分析结果也证实它是一种非分泌蛋白. 经BLAST同源蛋白质搜索，在Nonredundant SwissProt sequences和PDB protein database中均未查询到同源蛋白质. 结论： DPDP2所编码的蛋白是一种跨膜蛋白，具有信号转导分子的结构特征，又具有CKⅡ的磷酸化位点，可能与细胞分裂、转录调节过程有关.
 
　　【关键词】 牙髓/细胞学；牙龈；成纤维细胞；基因文库；序列分析；BLAST分析

　　0引言

　　人牙髓细胞（human dental pulp cell, HDPC）是牙髓组织在损伤、感染的情况下，具有自身修复能力的生物学基础［1］. 关于其再生、分化机制的研究，一直是近年来牙髓生物学的一个重要研究内容. HDPC具有区别于其他成纤维细胞的特性，即HDPC具有分化为成牙本质细胞进而形成牙本质的能力，而具有同样胚胎起源的牙龈成纤维细胞（Human gingival fibroblast, HGF）并不具备这种能力. 基因表达的变化处于控制生物学调节的中心位置［2］，因此，了解细胞差异基因的表达，有助于阐明生命的奥秘；同时，亦可以提示造成两种细胞表型差异的遗传学基础.
 　　
　　目前，人类及其他模式生物的基因资料在各种数据库中迅速增长. 要尽快读懂人类基因组的这10万个基因，利用这些现有的基因资料，分析其结构、功能，成为基因组后研究所要亟待解决的关键问题［3］. 我们在既往的研究中构建了HDPC与HGF cDNA消减文库并克隆得到了一条新的基因序列─DPDP2基因［4］. 本研究我们在此基础上，进一步测定了该克隆序列全长，并运用计算机软件PC/GENE 6.60版对其进行分析，以期为其结构、功能的最终阐明提供理论依据.
 
　　1材料和方法

　　1.1材料Bluescript KS和DH5α均为第四军医大学生化与分子生物学实验室所保存， 限制性内切酶购自华美生物工程公司，T4 DNA Ligase购自 Gibco BR（15224041）， DNA Marker DL2000购自TaKaRa Biotech（D501CA），核酸胶回收试剂盒购自Nucleo Trap Gel Extraction kit（CLONTECH），柱离心式质粒抽提纯试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司.

　　1.2方法

　　1.2.1HDPC与HGF的培养［5］取年龄10~20岁本院门诊患者因正畸需要而拔除的健康恒牙，并切取小块牙龈分别立即置含抗生素预冷的Hanks液中带回实验室，采用常规组织块法进行培养. 培养液为含150 mL/L胎牛血清的DMEM，培养条件为5 mL/L CO2,  37℃，饱和湿度. 培养的HDPC与HGF经抗波形丝蛋白，角蛋白单抗ABC法染色，以鉴定其细胞起源. 成活后进行传代培养，细胞传代至第4~10代细胞，待细胞呈对数生长并达到80%覆盖率时，收集细胞，立即进行总RNA提取.
 
　　1.2.2HDPC与HGFcDNA消减文库的构建，参照［4,6］进行.
 
　　1.2.3DPDP2基因的克隆、序列测定及BLAST分析① 纯化所选取的含有人牙髓细胞差异表达基因片段cDNA克隆，均以正向引物（T7）为测序引物，用自动序列分析仪按说明进行测序反应. 测序后，通过国际互联网（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）在GenBank序列数据库进行同源基因搜索: 同GenBank最新的数据库（20000131）进行同源初步比较、分析，以确定进一步的工作. ② 将目的克隆连接测序通用引物SP6,经质粒转化、扩增，测序. 将测序结果与原有结果相比较，进行拼接，以获得其序列全长［4］. 用BLAST软件，通过国际互联网（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）同GenBank最新的数据库（20000131）进行同源性比较，将新的序列提交GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez），申请登录号.
 
　　1.2.4DPDP2基因序列的计算机分析本研究使用计算机软件（PC/GENE 6.60），并通过国际互联网（internet）利用NCBI Genbank和SWISSPROT ProDom数据库对所测得的基因序列进行了以下几方面的分析： ① 基因序列同源性分析；用BLAST软件搜索基因库中是否已存在与所查询基因同源的基因，或查询基因与基因库中哪个基因同源性高. ② 局部组成复杂性(Local composition complexity, LCC)； 该 分析的目的是判断一个基因片段的性质. 编码区LCC值曲线平缓，接近于1，相对于非编码区要高得多. ③ 基因片段的编码区(RNY)及基因各个编码读框翻译分析：基其基本分析原则是在该基因片段中搜索是否存在长于200 bp的开放读框，如果有的话，则根据该读框中各种密码子的使用情况来计算其作为编码基因的可能性.
 
　　2结果

　　2.1DPDP2基因序列同源性及编码区经测序DPDP2基因序列全长810 bp，在GenBank数据库的登录号为AF268385. DPDP2基因没有一个完整的编码区. 经BLAST分析，DPDP2基因不具有开放读框，但其5′部分序列与KIAA0265 gene（来源于人骨髓基质细胞株KG1）的3′部分有200 bp的重复序列，二者可以拼接成一个长6172 bp的完整序列，将其命名为DPDPKIAA0265.
 
　　2.2DPDPKIAA0265的计算机分析

　　2.2.1DPDPKIAA0265基因编码的可能性分析DPDPKIAA0265完整序列全长6172 bp，该基因存在一个完整的编码区. 在编码区的上游同一读框内发现有终止码. 另外从计算机分析给出的编码区可能性也说明分析的基因起始部位(ATG)是真正的起始位点. 从LCC分析结果（图1），能明显看出该部分序列符合基因编码区的. 我们将其编码的可能蛋白命名为DPDPKIAA0265P，以做进一步的分析.

　　图1－图3　略      

　　2.2.2DPDPKIAA0265基因的各个编码读框翻译分析结果(ORF): 53 Frame 1Y I L G G G T S W T A Y S L N K I H A Y N L E T N A W E E I A T K P H E K I G F P A A R R C H S C V Q I K N D V F I C G G Y N G E V I L G D I W K L N L Q T F Q W V K L P A T Met P E P V Y F H C A A V T P A G C Met Y I H G G V V N I H E N K R T G S L F K I W L V V P S L L E L A W E K L L A A F P N L A N L S R T Q L L H L G L T Q G L I E R L K StoG F L D C S L I L E Met L I Stop（以下简略）.

　　2.3DPDPKIAA0265P的机分析DPDPKIAA0265P共编码了83个氨基酸，氨基酸组成分析发现其一级结构中亮氨酸含量最高，约占15%，提示其具有疏水性（图2）. 其二级结构由螺旋结构（helical conformation）、卷曲结构（extended conformation）和伸展部分（coil conformation）所组成. 它们可以通过α, β或α/β折叠而形成三级结构. 抗原表位分析发现它可能有3种抗原决定簇结构，即GluAsnLysArgThrGly, LeuIleGluArgLeuLys和GluLeuAlaTrpGluLys. 同时，DPDPKIAA0265P中还存在一种跨膜螺旋结构：FHCAAVTPAGCMYIHGGVV. 线粒体运输肽分析显示其有线粒体结构. 进一步的分泌信号分析结果（图3）也证实DPDPKIAA0265P是一种非分泌蛋白. 该蛋白含有1个糖基化位点，1个磷酸化位点，2个酰基化位点. 经BLAST同源蛋白质搜索，在nonredundant SwissProt sequences和PDB protein database中均未查询到同源蛋白质.
 
　　3讨论

　　基因表达的变化处于控制生物学调节的中心位置［2-3］，因此，了解细胞差异基因的表达，有助于阐明生命的奥秘，同时，亦可以提示造成两种细胞表型差异的遗传学基础. 基因功能的分析与鉴定是在人类基因组计划（HGP）的工作中一项极为重要的工作，同时也是工作中的难点. 近年来，有学者将计算机基因组技术引入到这个工作领域中，为分离人类疾病的候选基因及其功能预测，提供了有益的指导作用. DPDP2全长810 bp，经LCC, RNY及 ORF分析结果可以看出，该基因没有一个完整的编码区. 但经BLAST分析，DPDP2虽然不具有开放读框，但其5′部分序列与KIAA0265 gene的3′部分有一个长约200 bp的重复序列，二者可以拼接成一个长6172 bp的完整序列，将其命名为DPDPKIAA0265，将其编码的可能蛋白命名为DPDPKIAA0265P. KIAA0265 gene是Nagase等［7］在人男性骨髓髓样成纤维细胞株(male bone marrow myeloblast cell line)KG1中克隆得到的,其序列全长5551 bp. 在细胞内定位于q7. 他用BLAST分析发现其基因起始部位有一个编码401个氨基酸的开放读框，但没有起始码［5］. 由此提示，KIAA0265 gene还不是一个完整的基因. 进一步分析发现其一级结构中含有与信号转导机制相关的Kelch motif，没有跨膜结构.
    
　　我们将DPDPKIAA0265进行了编码区分析，结果发现在955~1203 bp处存在一个完整的编码区. 在编码区的上游同一读框内发现有终止码. 另外从计算机分析给出的编码区可能性也说明分析的基因起始部位(ATG)是真正的起始位点. 从LCC分析结果，能明显看出该部分序列符合基因编码区的. 据计算机分析，DPDPKIAA0265P共编码了83个氨基酸，氨基酸组成分析发现其一级结构中亮氨酸含量最高，约占15%，提示其具有疏水性. 其二级结构由螺旋结构（helical conformation）、卷曲结构（extended conformation）和伸展部分（coil conformation）所组成. 它们可以通过α, β或α/β折叠而形成三级结构. 抗原表位分析发现它可能有3种抗原决定簇结构. 同时，DPDPKIAA0265P中还存在一种跨膜螺旋结构： FHCAAVTPAGCMYIHGGVV. 线粒体运输肽分析显示其有线粒体结构. 进一步的分泌信号分析结果也证实DPDPKIAA0265P是一种非分泌蛋白. 该蛋白含有1个磷酸化位点. 该磷酸化位点是酪蛋白激酶β亚单位(Casein kinase Ⅱ, CKⅡ)的作用位点. CKⅡ在细胞核中含量很高，已知其与细胞分裂、转录调节密切相关,是一类极为重要的调节酶，但目前对其调节对象、调节方式所知甚少. CKⅡ能刺激DNA拓扑异构酶Ⅱα二磷酸化，同时也能提高其自身磷酸化，在核糖体组装和翻译过程中发挥重要作用［8］. 经BLAST同源蛋白质搜索，在nonredundant SwissProt sequences和PDB protein database中均未查询到同源蛋白质. 应用与Nagase等［7］不同的研究方法，我们在人牙髓细胞中克隆得到的基因可以与之拼接而组成一个完整的序列，这不能算是一种偶然. 人牙髓细胞与人骨髓髓样成纤维细胞在生物学特性上极为相似，核心的一点就是二者均具有形成“硬组织”的能力，这使得我们的发现又存在某种内在的必然性. 根据对DPDPKIAA0265P的计算机分析结果提示，DPDPKIAA0265P是一种跨膜蛋白，具有信号转导分子的结构特征；同时，它又具有CKⅡ的磷酸化位点，可能与细胞分裂、转录调节的过程有关. 这些都有待实验证实.
   
　　人类基因组计划（HGP）自1991年实施以来，在制图及部分生物的大规模测序方面已经取得了令人瞩目的成就. 特别是1996年人类和小鼠高精度遗传图谱最终版本的发表，标志着人类基因组计划的第一期工作已完成［9-11］. 目前，人类及其他模式生物的基因资料在各种数据库中迅速增长. 要尽快读懂人类基因组的这10万个基因，利用这些现有的基因资料，分析其结构、功能，成为基因组后研究所要亟待解决的关键问题. 虽然基因定位的实验分析方法已取得巨大进展，但在许多方面，计算分析的方法可与之提供互补信息，而且，较之更廉价且富有效率. 当前，人类及其他模式生物的基因资料在各种数据库中迅速增长，对生物信息学提出了新的要求. 已经建立了各种数据库，并与国际互联网联合，使信息高科技也引入这个领域［3］. 本研究中，我们在得到DPDP2基因克隆的基础上，测定了其序列全长，并运用计算机软件对其进行分析，证实其为新基因，其编码蛋白DPDPKIAA0265P是一种与牙髓细胞生长、分化相关的信号转导分子. 这为牙髓细胞生长、分化机制的研究提供了一条新的途径.

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