宫颈脱落细胞高危型人乳头状病毒核酸扩增微板杂交捕获检测的临床意义
［关键词］ 宫颈脱落细胞；人乳头状病毒；微板杂交捕获法
The Clinic Meaning of Cervical Cytological Speciments HPV Micro?plate Hybrid Capture Detection PCR Assays
Abstract： Objective To establish a rapid and sensitive method of detect cervical hisk?risk human papillomavirus infections in cervical cytological speciments. Methods HPV type 16/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 DNA were detected in 140 cervical specimens by Micro?plate Hybrid Capture Detection PCR Assys. Results In cervical cytological speciments of 56 LSIL ,18cases were positive high?risk HPV DNA(32.5%);25 cases were positive high?risk HPV DNA in 42 HSIL cytological speciments(59.5%);Among 31 ASCUS specimens,11 cases were positive high?risk HPV DNA(35.5%);for the other 9 cervical squmaous cell carcinomas specimens, 8 cases were positive high?risk HPV DNA(88.9%).Conclusion Micro?plate Hybrid Capture Detection PCR Assys is a rapid,easy,sensitive and special assay to detect high?risk HPV infection with cervical cytological specimens,it can be applied for large?scale screening and clinical diagnosis.
Key Words: Cervical cytological speciments; Human papillomavirus; Micro?plate Hybrid Capture Detection PCR Assays
大量研究结果显示人乳头状病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要病因。有报道宫颈鳞癌HPV感染高大93%～99%［1］,HPV DNA检测能大大改进目前进行宫颈癌细胞学筛查的有效性。目前HPV类型已鉴定出100余种亚型，其中感染生殖道的亚群有近30种，依其致病性不同分为高危型和低危型两大类。高危型HPV16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68等与宫颈癌发生相关，低危型HPV6/11/42/44等常引起生殖道湿疣等良性病变［2］，因此，检测宫颈是否感染高危型HPV感染成为筛查、预防宫颈癌的重要手段［3］。我们采用核酸扩增(PCR)微板杂交捕获检测技术，检测宫颈脱落细胞高危型HPV感染状况，以便建立快速、准确检测高危型HPV的有效方法，为临床判断宫颈病的趋势，制定和随诊计划提供有效的依据，对宫颈癌进行早期的筛查，从而在发病早期得以诊断，提高治愈率。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 收集2004年5月10日至2005年6月15日镇江市妇幼保健送检的异常宫颈脱落细胞140份。
1.1.2 仪器 博日荧光定量PCR检测仪、BIO RAD 550型酶标仪。
1.1.3 试剂 高危型HPV16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 PCR微板杂交捕获检测试剂盒由港龙生物技术(深圳)有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞标本 用无菌棉试子插入宫颈口，紧贴转动2周，取得脱落细胞，放入含1 ml无菌生理盐水的样品管中，充分漂洗后，棉试子贴壁挤干丢弃。1 300 r离心5 min，取沉淀细胞提取DNA。
1.2.2 细胞学检验 按宫颈细胞学描述性诊断(the Bethesda system,TBS)分类，分别诊断为低度鳞状上皮内皮病变(low grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)、高度鳞状上皮内皮病变(high grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)，未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cell of undetermined significance,ASCUS)，未明确诊断意义的不典型腺上皮细胞，鳞状细胞癌(atypical glandular cell of undetermined significance,AGCUS)等。
1.2.3 DNA提取 将标本沉淀物加入50 ml DNA提取液，振荡混匀；沸水10 min，1 300 r离心10 min，样本上清液直接用于PCR检测。
1.2.4 DNA扩增 各管加入样本上清液，按下列条件扩增：50 ℃5 min；预变性95 ℃10 min；95 ℃30 s，52 ℃45 s，65 ℃30 s，共做45个循环；最后65 ℃延伸5 min。
1.2.5 微板杂交和显色 按说明把PCR扩增产物加到微板孔中反应并显色，用酶标仪读板，A值＞0.7为阳性，A值＜0.5为阴性。
2 结果
2.1 细胞涂片结果 140例异常宫颈脱落细胞中诊断为LSIL 56例，HSIL 42例，ASCUS 31例，AGCUS 2例，鳞状细胞癌9例。
2.2 PCR微板杂交捕获检测高危型HPV DNA 对140例细胞涂片诊断为LSIL、ASCUS、AGCUS及鳞状细胞癌的宫颈脱落细胞进行高危型HPV检测。结果显示LSIL 56例，高危型HPV阳性18例(32.5%)；HSIL 42例，高危型HPV阳性25例(59.5%)；未明确诊断意义的ASCUS 31例，高危型HPV阳性11例(35.5%)；鳞状细胞癌9例，高危型HPV阳性8例(88.9%)，见表1。
表1 脱落细胞微板杂交捕获检测高危型HPV DNA结果（略）
3 讨论
子宫颈癌是居第二位的女性常见恶性肿瘤，近年来大量流行病学资料显示，HPV中尤其是高危型HPV感染，如HPV16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68与子宫颈癌发病密切相关［4］。我国宫颈癌患病率和病死率均较高，宫颈癌的发生与HPV感染密切相关，因此检测HPV感染成为预防和筛查宫颈癌的重要手段，特别是高危型HPV的检测尤为重要。美国食品和产品监督管理局(FDA)批准了在30岁以上妇女中使用细胞学与检测引起宫颈癌的人乳头瘤病毒(杂交捕获试验)相结合的初筛方法［5］。此前的一些检测方法只能检测高危型HPV16/18型DNA，这对宫颈癌的筛查和预防有明显的不足，我们采用微板杂交捕获法检测宫颈脱落细胞高危型HPV DNA中的13个型，大大提高了筛查的准确性，对140例宫颈脱落细胞进行了13型高危HPV DNA检测。结果显示13型高危HPV DNA在LSIL阳性率32.5%、HSIL为59.5%、ASCUS为35.5%、鳞状细胞癌为88.9%。微板杂交捕获法采用96孔平板法和非放射性RNA为探针，对抗体捕获信号进行显色检测，可检测13种高危型HPV DNA。该法是目前国内外新的检测方法，具有灵敏度高和特异性强等优点［6］。由原先的试管法该为96孔平板法，利用率高，适用于大规模的群体筛查。该法用酶标仪读数，检测结果客观且重复性好［7］。此外，利用阳性梯度的标准值制成曲线，再根据A值就可以确定起始DNA的数量。该技术把基因扩增、分子杂交、酶免显色融为一体，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，既适用于大规模筛查由适用于临床日常工作。但其局限性只能将HPV分为高危和低危，而不能进行基因分型，并且对HPV新的型有多少交叉反应不明确，但该法仍可作为宫颈癌筛查手段，筛选高风险人群。
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