STZ 建立 2 型糖尿病大鼠模型的剂量探讨

【摘要】  目的：探讨链脲佐菌素（streptozocin, STZ）腹腔注射建立 2 型糖尿病（T2DM）大鼠模型的最佳注射剂量。方法：4 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠高糖高脂饲料喂养 4 周，分别按 30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg 体重剂量腹腔注射 STZ 建立 T2DM 大鼠模型，观察成模大鼠各阶段体重、食量、饮水量、尿量变化；检测空腹血糖（FBG）、胰岛素（FINS）、血脂，比较各组大鼠模型稳定性。结果：40 mg/kg 剂量组大鼠的成模率最高（73.3%），成模大鼠具有胰岛素抵抗、高血糖、高胰岛素血症和血脂紊乱的 T2DM 临床特征，高血糖持续时间最长、最稳定（到实验结束模型稳定至少 28 d）。30 mg/kg 剂量组大鼠成模率只有 40%，成模大鼠于实验结束血糖水平已基本恢复正常，50 mg/kg 剂量组成模大鼠倾向于 1 型糖尿病。结论：短期高糖高脂饮食联合 STZ 腹腔注射建立 2 型糖尿病 SD 大鼠模型的 STZ 最佳注射剂量为 40 mg/kg。

【关键词】  2 型糖尿病；大鼠模型；链脲佐菌素

    〔Abstract〕 Objective To  explore  the  best  dosage  of  streptozocin  (STZ)  what  was  used  to  induce  rat   model  of   Type  2  diabetes  mellitus  (T2DM).  Methods   Sixty  4  weeks  old  male  Sprague  Dawley  (SD)  rats  were  fed  with  high  fatty  and  high  sugar  diet  for  4  weeks,  then  STZ  (30  mg/kg、40  mg/kg、50  mg/kg)  was  injected  intraperitoneally  to  make  rat  model  of  T2DM,  each  phase  avoirdupois,  appetite  and  the  amount  of  urine  and  drinking  of  rat  model  were  tested,  in  unison,  the  fasting  blood  glucose  level  (FBG),  serum  insulin  level  (FINS)  and  blood  lipid  were  also  detected,  the  data  was  used  to  evaluate  the  stability  of  the  rat  model  of  T2DM.    Results  The  40  mg/kg  group  has  the  highest  making  model  success  rate  of  over  73.3%,  all  the  succeed  model  rat  has  insulin  resistance,  hyperglycemia,  blood  lipid  disorder  and  blood  insulin  increased  which  were  the  typical  characteristic  of  T2DM,  and  duration  of  high  blood  glucose  was  the  longest  and  the  most  stabile  too.  Only  40%  of  the  30  mg/kg  group  has  succeed,  beside  the  blood  glucose  level  has  get  right  until  the  end  of  experimental.  The  successful  rat  models  of  the  50  mg/kg  group  were  inclined  to  type  1  diabetes  mellitus.   Conclusion  Associate  with  high  fatty  and  high  sugar  diet  feeding  shortly,  the  best  dosage  of  STZ  which  was  used  to  induce  rat  model  of  T2DM  is  40  mg/kg.

    〔Key  Words〕  Type  2  diabetes  mellitus;  Rat  model;  Streptozocin

    随着人们生活水平的提高和饮食结构的变化，糖尿病的发病率逐年递增，糖尿病已成为仅次于肿瘤和心血管疾病之后的第三大健康杀手[1]，在我国，实际患糖尿病人数已达 4 000 万以上，其中 2 型糖尿病（T2DM）占整体糖尿病患者的 95%，2 型糖尿病的研究意义重大。复制与人体接近的T2DM实验动物模型是进行 T2DM 研究的关键环节之一。近年来，众研究人员多推崇采用高热量饮食联合 STZ 注射的方法诱导 T2DM 大鼠模型。STZ 对动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用，破坏动物的胰岛β细胞，导致糖尿病[2]，但它对机体其他组织的毒性作用相对较小，采用 STZ 注射法复制 T2DM 大鼠模型，大鼠存活率高，成模状态持续时间长，模型稳定。然而，参阅众，STZ 的使用剂量各不相同，其模型状况也各不一样，因此，探索一个合适的 STZ 注射剂量，建立更长期稳定的 T2DM 大鼠模型，能够为糖尿病新药的开发及其慢性并发症的研究提供更理想的动物实验技术平台。本实验在阅读相关文献的基础上，通过不同 STZ 剂量组间对比，摸索建立长期稳定的 2 型糖尿病大鼠模型的 STZ 最佳注射剂量。

    1    材料和方法

    1.1    动物与饲料    SPF 级雄性 SD 大鼠 60 只，4 周龄，体重 85~95 g。SPF 级普通饲料。高糖高脂饲料：即普通饲料中加入 20% 的脂肪（50% 猪油和50% 蛋黄粉）和 20% 蔗糖，搅拌机混匀成型，烤熟后真空包装，于深圳市金鹏源辐照技术有限公司 60Co 照射消毒灭菌至 SPF 级备用。动物和饲料及加工原料均由广东省实验动物中心提供〔实验动物生产许可证：SCXK（粤）2003-0002 粤监证字 2006A015；普通饲料成分：小麦、玉米、进口鱼粉、氨基酸、维生素、矿物元素添加剂等组成〕。

    1.2    试剂与仪器    链脲佐菌素（STZ）：美国Sigma 公司；柠檬酸（C6H8O7.H2O）：广东台山粤侨试剂塑料有限公司生产，批号：20060501；二水柠檬酸三钠（C6H5Na3O7.2H2O）：上海通直精细化工厂生产，批号：20050511；血糖仪、血糖试纸：美国强生稳豪血糖仪及其配套试纸；Beckman-CX7 全自动生化仪：美国贝克曼库尔特有限公司；FMJ 全自动放射免疫-计数器。

    1.3    动物喂养及分组    所有 SD 大鼠 SPF 环境饲养，环境温度为 20~25℃，湿度 56%，自由饮水，12/12 h 昼夜，喂食时间为每日下午 5 点至次日上午 8 点。大鼠适应性饲养 1 周后禁食不禁水12 h，剪尾取血测血糖，称体重，随机分为 4 组：A 组（普通饲料组，即正常对照组）15 只，B、C、D 组（高糖高脂饲料 + STZ 注射组，即模型组），每组各 15 只，每笼 5 只喂养。

    1.4    造模方法    各大鼠血糖值均在 5.5~6.5 mmol/L，属正常范围。A 组喂以普通饲料，B、C、D 组大鼠均喂以高糖高脂饲料，4 周后，禁食不禁水 12 h，4 组的大鼠测体重，剪尾取血后 A 组按 0.1 mL/100 g 体重剂量腹腔注射柠檬酸缓冲液（0.1 mmol/L, pH 4.4），B、C、D 组分别按 30 mg/kg；40 mg/kg；50 mg/kg 体重剂量一次性腹腔内注射STZ（溶于 0.1 mmol/L 柠檬酸缓冲液，pH 4.4，终浓度分别为 3%、4%、5%，冰浴，现配现用，5 min 内用完）。

    1.5    模型筛选    模型组大鼠注射 STZ 72 h 后测空腹血糖（FBG）。FBG ≥ 16.7 mmol/L 者确定为糖尿病大鼠模型。各组成模率和死亡率。

    1.6    模型维持状况观察    监测各组成模大鼠第0、7、14、21、28 天下午 5 点血糖。观察大鼠食量、饮水量、尿量及体重变化。

    1.7    统计学方法    数据采用 x±s 表示，组间差异采用单因素方差分析，统计软件为 SPSS 13.0 软件包。

    2    实验结果

    2.1    各组大鼠体重变化    用高糖高脂饲料喂养 4 周后，模型组大鼠体重显著高于正常对照组（P < 0.05），成功诱导肥胖。实验结束时，与注射 STZ 前比较，B 组大鼠体重增加 23.2%（P < 0.05），C 组大鼠体重改变无统计学意义，D 组大鼠体重显著低于 STZ 注射前（P < 0.05），详见表 1。

    2.2    各组大鼠成模率比较    模型组大鼠注射STZ 72 h 后测 FBG，FBG ≥ 16.7 mmol/L 者确定为糖尿病大鼠模型，其中 C 组成模率最高，详见表 2。

    2.3    各组大鼠代谢特征比较    用高脂饲料喂养 4 周后，与正常对照组相比，模型组大鼠食量增大，血清总胆固醇、甘油三酯、空腹胰岛素、低密度脂蛋白水平均明显升高（P < 0.05），高密度脂蛋白显著降低（P < 0.05），血糖升高虽无统计学意义，但根据李氏[3]胰岛素敏感指数计算方法〔IAI=ln（1/FINS ×FBG）〕，模型组 IAI 与正常对照组比较差异性显著（P < 0.05），结果表明已经成功诱发出胰岛素抵抗。实验结束时，模型组大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、空腹胰岛素、低密度脂蛋白水平仍明显高于正常对照组（P < 0.05），高密度脂蛋白显著低于正常对照组（P < 0.05），IAI 与正常对照组比较差异显著（P < 0.05），具有 T2DM 的临床特征，详见表 3。同时，STZ 注射后，与正常对照组相比，模型组大鼠的摄食量继续增加，均出现了多饮多尿现象，B 组大鼠饮水量、尿量随着时间的延长有相对减少，于实验结束基本恢复正常；C 组、D 组大鼠饮水量、尿量到实验结束未见减少，C 组大鼠饮水量、尿量增加 2~3 倍，D 组大鼠饮水量、尿量分别增加 4~5 倍。

    2.4    各组成模大鼠血糖变化    模型组大鼠在成模后的第 0、7、14、21、28 天下午 5 点剪尾取血，用美国强生稳豪血糖仪测血糖，结果显示，50 mg/kg 剂量组成模大鼠各阶段血糖均大于 33.3 mmol/L（血糖仪器显示：HI，提示大于 33.3 mmol/L，表 3 均用33.3 表示），30 mg/kg、40 mg/kg 剂量组成模大鼠分别于 STZ 注射 3 d 后显示一个高血糖值，此血糖浓度维持 1 周左右，第 7 天开始有所下降，30 mg/kg 剂量组成模大鼠血糖下降较快，到第 28 天均降至16.7 mmol/L 以下，40 mg/kg 组成模大鼠血糖到实验结束仍然维持一个较稳定的高血糖浓度，详见图 1。

    3    讨论

    2 型糖尿病是以胰岛素抵抗和持续高血糖为主要特征的代谢紊乱综合征。目前，在 T2DM 的研究中，国内外学者的实验已证实高热量饮食 + STZ 注射是复制 T2DM 大鼠模型的重要条件[4-6]：高热量饮食可以导致肥胖，肥胖引起胰岛素抵抗，并产生高胰岛素血症、血脂紊乱等一系列 2 型糖尿病临床特征；STZ 选择性损伤胰岛β细胞，导致高血糖；两者的联合作用可以成功诱导出具有胰岛素抵抗和高血糖特征的 2 型糖尿病大鼠模型[6-8]。但是，此种方法复制 T2DM 大鼠模型，各研究人员所使用的 STZ 剂量不尽相同，本研究采用短期高糖高脂饲料喂养联合三种不同剂量（30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg）STZ 腹腔注射的方法制备实验性 T2DM 大鼠模型，通过比较组间模型差异，探讨复制 T2DM 大鼠模型的最佳 STZ 注射剂量。

    实验结果显示，实验大鼠用高糖高脂饲料喂养 4 周后，成功诱导胰岛素抵抗、高胰岛素血症、血脂紊乱等 2 型糖尿病的主要临床特征。同时，STZ 注射后，与正常对照组相比，模型组大鼠均出现了多饮多尿现象，30 mg/kg 剂量组大鼠饮水量、尿量随着时间的延长有相对减少，至实验结束，基本恢复正常；40 mg/kg 剂量组大鼠饮水量、尿量增加 2~3 倍，50 mg/kg 剂量组大鼠饮水量、尿量增加 4~5倍，到实验结束亦未见减少。STZ 注射 3 d 后进行模型筛选，30 mg/kg 剂量组大鼠成模 6 只，成模大鼠血糖均值最高达到 16.9 mmol/L，但是在 1 个月内均逐渐下降至 16.7 mmol/L 以下，接近正常水平；50 mg/kg 剂量组大鼠成模 10 只，到实验结束，成模大鼠血糖值始终维持在 33.3 mmol/L 以上；而 40 mg/kg 剂量组大鼠成模 11 只，从造模成功到实验结束，成模大鼠血糖水平始终维持在一个相对较高水平，于实验结束均值仍高达 17.8mmol/L。血糖变化主要与β细胞损伤的程度密切相关，β细胞损伤过于轻微，残存胰岛细胞代偿作用可迅速使血糖恢复为正常状态（如 30 mg/kg 剂量组），而β细胞损伤过于严重，则倾向于 1 型糖尿病（如 50 mg/kg 剂量组）。本实验 40 mg/kg 剂量组成模大鼠具备胰岛素抵抗、高血糖、高胰岛素血症、血脂紊乱等 2 型糖尿病的主要临床特征，且达到成模标准后能维持足够长时间，到实验结束模型稳定至少 28 d，优于 30 mg/kg 和 50 mg/kg 剂量组大鼠模型，短期高热量饮食联合 STZ 腹腔注射建立 2 型糖尿病 SD 大鼠模型的 STZ 最佳注射剂量为40 mg/kg，能为 T2DM 防治药物及其并发症的研究提供理想的 T2DM 大鼠模型。

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〔3〕李光伟, 潘孝仁, Stephen Lillioja, 等. 检测人群胰岛素敏感性的一项新指数〔J〕. 中华内科杂志, l993, 32(10):656

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