苦参碱对肺腺癌细胞生长抑制的实验研究

                 作者：耿国军 姜杰 杜好信 姚成才 陈端扬 陈隽鹏 张义 

【摘要】  目的：研究分化诱导剂苦参碱(Matrine)在体外对人肺腺癌SPC?A?1细胞生长抑制的影响。方法：用不同浓度的苦参碱分别处理肺腺癌SPC?A?1细胞后，镜下观察癌细胞的生长情况；测定软琼脂克隆形成率；MTT (噻唑蓝)法测定生长抑制率。结果：不同浓度苦参碱处理后肺腺癌SPC?A?1细胞的生长明显受到抑制，细胞生长抑制率随苦参碱的浓度增加而增强。结论：苦参碱对肺腺癌SPC?A?1细胞的生长有明显的抑制作用。

【关键词】  肺腺癌 SPC?A?1细胞 苦参碱 生长抑制

研究表明，苦参碱具有抗炎、抗纤维化、抗病毒及抗肿瘤等多方面生物活性 [1]。为探讨苦参碱对肺腺癌细胞的生长抑制作用，本研究选择肺腺癌细胞进行体外实验，通过一定浓度的苦参碱处理肺腺癌细胞一定时间后，观察其对肺腺癌细胞的生长抑制效果，为临床肺癌提供一定的理论依据。

    1  材料与方法 

    1.1  材  料  苦参碱购自江苏连云港，配制为20g/L的无菌溶液备用。流式细胞仪，为美国产品。肺腺癌SPC?A?1细胞株由厦门大学生命学院提供。小牛血清购自杭州四季青生物工程公司，实验时选用对数生长期细胞。

    1.2  细胞培养  随机取5瓶处于对数生长期的SPC?A?1细胞，在其中的4瓶内加入苦参碱，苦参碱浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.0mg/ml。及时更换新鲜培养基，同时保持药物浓度不变，连续培养，观察细胞增殖情况。剩余的1瓶正常培养作为对照。

    1.3  软琼脂克隆形成测定  参照鄂征等[2]方法，苦参碱浓度分别为0、0.25、0.50、0.75、1.0mg/ml，连续培养2周，克隆形成率与克隆抑制率。

    克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100％；克隆抑制率=(1?实验组克隆数/对照组克隆数)×100％

    1.4  MTT法检测细胞生长抑制率  参照司徒镇强[3]等方法，调整细胞浓度至103～104/ml，并使细胞分散良好；将稀释的细胞悬液加到96孔培养板内，每孔200μl。4～5小时细胞贴壁后，加入不同浓度的苦参碱，使不同组的终浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.0mg/ml，对照组加等量的培养基。微型震荡器震荡后，用酶标仪于波长492nm处测吸光度值(OD)。计算抑制率。

    1.5  统计学分析  全部数据以（±s）表示，显著性比较用t检验。

    2  结  果 

    2.1  不同浓度的苦参碱对SPC?A?1细胞生长的影响  苦参碱对SPC?A?1细胞在24小时显示出生长抑制作用，48、72小时抑制作用较明显。0.25mg/ml、0.50mg/ml、0.75mg/ml、1.00mg/ml苦参碱均可抑制SPC?A?1细胞增殖，且随浓度增加对SPC?A?1的抑制率也增强，48小时抑制率分别为4.36％、9.45％、15.28％、20.73％。不同浓度组间抑制率比较差异有统计学意义。且同一浓度苦参碱对SPC?A?1的抑制率随时间延长而增加，见表1。表1  苦参碱对SPC?A?1细胞增殖的影响

    2.2  苦参碱对SPC?A?1细胞软琼脂克隆形成能力的影响  随苦参碱浓度增加，其克隆形成率逐渐下降，克隆抑制率逐渐上升，增殖抑制更加明显，见表2。表2  对SPC?A?1细胞克隆形成率及抑制率的影响

　　2.3  苦参碱对SPC?A?1细胞生长抑制力的影响  不同浓度的苦参碱对SPC?A?1细胞作用24小时后，吸光度值(OD)逐渐下降，其生长抑制率逐渐增加，见表3。表3  对SPC?A?1细胞生长抑制率的影响

   3  讨  论 

    高增殖活性是恶性肿瘤的重要生物学特性之一，也是临床患者死亡的主要原因。因此，对肿瘤生长抑制的研究已经成为肿瘤学研究的主要内容。肺癌是目前发病率和死亡率增长最快、对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[4]。肺癌的预后仍较差。肺癌的高侵袭及转移的生物学特性多年来一直困扰着临床治疗工作，寻找新的治疗方法和有效抗癌药物具有相当重要的意义。药研究证实，苦参中所含的苦参碱、氧化苦参碱等生物碱成分具有抗肿瘤活性。

    近年来，随着恶性肿瘤的诱导分化疗法的日益兴起，苦参碱作为一种具有临床应用价值的诱导分化剂已引起研究者越来越多的关注和兴趣。观察对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用是筛选诱导分化剂的基本指标。本研究中，我们通过较长时间观察SPC?A?1细胞的扩增传代发现，在苦参碱的作用下，SPC?A?1细胞增殖减慢，随苦参碱浓度增加，其增殖抑制更加明显，最后停止生长。虽然其中可能发生细胞的凋亡或死亡，但细胞增殖抑制是肯定的。软琼脂克隆形成实验及MTT法是测定单个细胞增殖能力及检测细胞存活和生长的有效方法[5]。为进一步证实苦参碱对SPC?A?1细胞的抑制作用，笔者应用软琼脂克隆形成实验及MTT法。结果表明，随着药物浓度的增加，其生长抑制率及克隆抑制率明显增高。这与其他的研究报道[6～8]一致。

    综上结果分析，一定浓度的苦参碱能有效抑制SPC?A?1细胞的生长增殖，并且随苦参碱浓度的增加其抑制作用明显增加。其作用机制可能与苦参碱调控SPC?A?1细胞的凋亡表达有关，不是单纯的细胞毒性坏死。随着分子生物学技术的不断,特别是基因芯片和蛋白芯片技术的发展,必将对苦参碱类抗肿瘤机制的研究起到很大的推动作用,而针对这些机制的研究定会开发出新型的与苦参碱类抗肿瘤作用同一分子靶点的药物,这将为肿瘤的治疗开辟一条新途径。

【】
  1 陈伟忠，林 勇，谢渭芬．苦参碱抗肿瘤机制的研究进展．肿瘤，2002,8(1)：4?6

2 鄂 征.组织培养与细胞技术．第2版．北京：北京出版社，1996

3 司徒镇强．细胞培养．西安：兴国图书出版公司，2002

4 孙 燕.内科肿瘤学.北京：人民卫生出版社,2001.640

5 范临夏，陶晓南，蔡曦光，等.苦参碱诱导A549细胞凋亡的机制研究.第四军医大学学报，2007，28(15)：1359?1362

6 Zhang LP,Zhang M,Zhou JP,et al.Antifibrotic eEffect of Matring on vitro and vivo models of liver fibrosis in rats.Acta Pharmscol Sin,2001,22(2):183?186

7 王 源，司维柯，李 鹏，等．苦参碱及氧化苦参碱抑制A?549细胞增殖及诱导细胞凋亡的比较研究.第三军医大学学报，2004,26,(9)：778?780

8 李旭芬,张苏展.苦参碱对K562细胞端粒酶hTERT?mRNA表达及其酶活性影响作用的研究.癌症,2001,20(4):391?393