碘化N-正丁基氟哌啶醇对缺氧血管平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制的研究

                作者：刘清,石刚刚，陈一村，周燕琼，郭福晓，郑燕珊   

【摘要】  目的:研究碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)对缺氧大鼠胸主动脉平滑肌细胞(SMCs)增殖的影响，并探讨其作用机制是否与早期生长反应基因-1(egr-1)有关。方法:取第3～4代培养的大鼠胸主动脉SMCs制作缺氧模型，应用噻唑蓝比色法检测细胞增殖情况,流式细胞术测定细胞周期,蛋白印迹杂交方法检测Egr-1及血小板源生长因子(PDGF-A)蛋白表达情况。结果:与缺氧组比,反义寡核苷酸组及F2组比色吸光度A值、细胞周期S+G2/M期比例均下降(P<0.01)，Egr-1及PDGF-A蛋白表达均减少。结论:F2可通过抑制Egr-1蛋白表达来抑制缺氧SMCs的过度增殖。

【关键词】  碘化N-正丁基氟哌啶醇;血管平滑肌细胞；缺氧;增殖；反义寡核苷酸;早期生长反应基因-1

　　［Abstract］Objective : To investigate the effect and mechanism of N-n-butyl haloperidol iodide(F2)on hypoxia-induced proliferation of rat thoracic aortic smooth muscle cells(SMCs)in vitro， and to indicate the relationship between the effect of F2 and the express of early growth response gene-1(egr-1). Methods:　Passages 3 to 4 of cultured rat thoracic aortic SMCs were used to establish hypoxia models. The viability of VSMC was detected by mono-nuclear cell direct cytotoxicity assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. The levels of Egr-1 and PDGF-A were assessed by Western blot. Results: Compared with the hypoxia group,　the absorption value,proliferation index and the levels of Egr-1 and PDGF-A of antisense oligodeoxynucleotide group and F2 group were all decreased.　Conclusion: The inhibition of F2 on hypoxia-induced proliferation of rat thoracic aortic SMCs in vitro is mediated by Egr-1.

　　［Key Words］N-n-butyl haloperidol iodide; vascular smooth muscle cell; Hypoxia; proliferation； antisense oligodeoxynucleotides; early growth response gene-1

    碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)是本实验室设计合成的一种新型氟哌啶醇季铵盐衍生物,已有实验表明它对心肌缺血再灌注损伤以及心肌细胞、内皮细胞缺氧复氧损伤具有保护作用，且这种作用与抑制早期生长反应基因-1(egr-1)mRNA及蛋白表达水平的过度升高有关［1～6］。缺氧可致血管平滑肌细胞(VSMCs)的过度增殖［7］，进而导致一系列血管增生性疾病。本研究拟在观察F2对心脏整体、离体以及内皮细胞的作用基础上，进一步观察F2对缺氧诱导的VSMCs增殖的作用及其与Egr-1的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器与试剂

    倒置相差显微镜(上海光学仪器厂,);超净工作台(苏州净化设备有限公司,中国);CO2培养箱(Thermo Forma公司,美国);凯基MTT细胞增殖检测试剂盒以及细胞周期检测试剂盒(凯基生物科技有限公司，中国)；multiskan spectrum酶标仪(Thermo Labsystem公司,芬兰);FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司，美国)；聚丙烯酰胺凝胶电泳相关材料(Bio-RAD公司,美国);硝酸纤维素膜(Invitrogen公司,美国)；F2(汕头大学医学院药物研究室化学组合成,结构由中国院上海有机化学所鉴定,实验前用聚乙二醇溶解配成);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司,中国);M199培养基、胰蛋白酶(GIBICO公司,美国);Egr-1 1抗以及血小板源生长因子-A(PDGF-A)1抗(Santa Crutz公司,美国);α-SMactin 1抗、辣根过氧化物酶标记2抗、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、3,3′－二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，中国);Egr-1反义寡核苷酸(AD-ODN)、正义、错义寡核苷酸(大连Takara公司,中国)。

　　1.2  大鼠胸主动脉VSMCs培养及鉴定

    SD大鼠断颈处死，放血，无菌条件下取出胸主动脉,去除血管内、外膜,将中膜组织以贴块法行原代培养,细胞融合后用质量分数0.25%的胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察,呈现VSMCs特征性的“峰”、“谷”状生长。小鼠抗大鼠α-SMactin单克隆抗体免疫细胞化学鉴定,阳性细胞达95%以上,实验用第3～4代细胞。

　　1.3  寡核苷酸的细胞转染方法及荧光标记检测

    平滑肌转染前1d换用无血清无抗生素培养基培养，先将脂质体LipofectamineTM 2000 Reagent溶入转染液(M199培养基)中，每800μL转染液稀释32μL脂质体，轻轻混匀，室温孵育5min。同时将AD-ODN、正义或错义寡核苷酸也溶入转染液中，每800μL转染液稀释16μg寡核苷酸，轻轻混匀，然后将两者混合，室温孵育20min,加入到6400μL的M199培养基中,用此溶液换掉原培养基,继续培养36h后进行下一步实验。将5′端有异硫氰酸(FITC)标记的AS-ODN转染VSMCs(步骤同上)，入37℃、体积分数5%的CO2细胞培养箱中避光培养8h，然后在488nm的激发光源下观察荧光标记的AS-ODN转染情况。

　　1.4  实验分组

    取3～4代SD大鼠胸主动脉VSMCs随机分为对照组；缺氧组；F2组(1×10-6mol/L)；PEG组(1×10-6mol/L)；AS-ODN组；正义寡核苷酸组；错义寡核苷酸组；脂质体组(寡核苷酸的转染按其细胞转染方法进行)。所有组用无血清培养基孵育24h后换成体积分数10％的胎牛血清培养基，除对照组在37℃、5% CO2普通细胞培养箱内孵育16h外，其余组均放入自制的缺氧盒［5］内缺氧16h。

　　1.5  MTT比色法测定VSMCs增殖

    将细胞消化制成5×107个/L的细胞悬液，以每孔100μL的量接种于96孔培养板中，用含10%胎牛血清的M199培养液置37℃、5% CO2细胞培养箱中培养24h，按照实验分组要求培养后，每孔加入50μL 1×MTT溶液,在37℃继续孵育4h后吸出上清液,每孔加入150μL DMSO,用平板摇床摇匀，用酶标仪在550nm波长处检测每孔的吸光度(A值)。

　　1.6  VSMCs细胞周期的测定

    取第3代生长良好的VSMCs,按实验分组要求培养后分别消化,离心,收集细胞于离心管,再用PBS洗涤细胞1次(106g,离心10min),收集并调整细胞浓度为1×109/L的细胞悬液,用体积分数70％的冷乙醇固定,4℃保存。染色前用PBS洗去固定液，加100μL RNaseA 37℃水浴30min,再加入400μL PI染色混匀，4℃避光30min,上机检测。

　　1.7  Egr-1及PDGF-A蛋白测定

    Egr-1蛋白测定用的是缺氧2h模型，PDGF-A蛋白测定用的是缺氧16h模型。做完模型后培养瓶中的细胞用PBS洗涤2次,0.25%的胰蛋白酶和质量分数0.2%的乙二胺四乙酸(1∶1)消化收集,再加入PBS漂洗2次,106g,离心10min(4℃),弃上清液,沉淀中加入适量的单去污裂解液,冰上裂解30min。15294g,离心10min(4℃),取上清液,采用Bradford法测定蛋白浓度。加入5×上样缓冲液,100℃变性4min后备用。

    配制质量分数10%(测Egr-1时)或15％(测PDGF-A时)的分离胶与质量分数5%的浓缩胶,完全凝固后,每泳道加70μg蛋白样品,经电泳(125V,70min)和转膜(100V,60min)后,在封闭液中封闭2h,然后加入1∶400的Egr-1或PDGF-A抗体稀释液,4℃过夜,缓冲液洗膜3次,每次10min,再加1∶2000的二抗稀释液室温孵育2h,洗膜3次,每次10min,加化学发光试剂于膜上,反应1min,压片,曝光后将胶片进行显影、定影。

　　1.8  统计学处理

    结果以x±s表示，用SPSS 11.0统计软件进行分析,用单因素方差分析进行组间比较。

　　2  结果

　　2.1  AS-ODN在VSMCs中的转染

    同一视野下，SMCs所在位置与FITC标记的AS-ODN发光的位置相一致，成功转染入VSMCs(图1)。

　　2.2  F2及AS-ODN对VSMCs增殖的影响

    与缺氧组比,F2、AS-ODN组的吸光度A值均下降(P<0.01)，说明AS-ODN和F2均能抑制缺氧诱导的VSMCs增殖(表1)。表1  各组VSMCs的吸光度A值（略）

　　2.3  F2及AS-ODN对VSMCs细胞周期的影响

    与缺氧组比,F2、AS-ODN组均可使S＋G2/M期的细胞比例下降,G0/G1期的上升(表2)。表2  各组VSMCs的细胞周期（略）
　　2.4  F2及AS-ODN对VSMCs的Egr-1和PDGF-A蛋白表达的影响

    与缺氧组比,F2、AS-ODN组的Egr-1以及PDGF-A蛋白表达均减少(图2、3)。

　　3  讨论

    F2可改善心肌缺血再灌注损伤；心肌细胞、内皮细胞缺氧复氧模型上,可降低egr-1　RNA及蛋白表达水平，减弱细胞炎症反应的程度。F2对缺血再灌注心肌组织损伤和缺氧复氧心肌、内皮细胞损伤具有良好的保护作用。

    Egr-1与血管损伤后VSMCs增殖与再生密切相关［8，9］。冠状动脉扩张后再狭窄的发生机制与egr-1基因转录的激活有着密切联系。Khachigian等［10］用靶向egr-1基因的AS-ODN方法明显抑制了球囊扩张术后再狭窄的发生。Santiago等［11］用靶向egr-1基因的AS-ODN在机械损伤的模型上,证实了这种损伤所致VSMCs增殖与再生是egr-1依赖性的。实验证实AngⅡ上调VSMCs的PDGF-A链表达也是egr-1依赖性的［12］。实验中，我们检测了不同缺氧时间VSMCs增殖情况以及不同缺氧时间Egr-1蛋白的表达水平，发现在缺氧16h　VSMCs增殖最明显，而Egr-1表达在缺氧1h后明显升高，2h达高峰，此后逐渐下降，直到20h仍然高于对照组。因此，我们将靶向egr-1　mRNA的AS-ODN转染入VSMCs,在缺氧模型上观察到AS-ODN组VSMCs的过度增殖受到明显抑制，证实了egr-1与缺氧所致的VSMCs增殖的因果关系，这与报道相一致。

    PDGF可促进多种细胞的分裂增殖。研究表明，PDGF作为egr-1的下游基因，在VSMCs增殖中发挥关键作用［8］。本实验表明，用靶向AS-ODN抑制egr-1基因的表达后，PDGF-A表达也明显下降,提示PDGF诱导VSMCs的增殖与egr-1有关。通过MTT比色法，表明F2、AS-ODN组均能抑制VSMCs增殖。流式细胞实验结果表明，F2、AS-ODN组均能降低缺氧VSMCs的S期和G2/M期细胞的比例，增加G0/G1期细胞比例，抑制VSMCs的过度增殖。Western blot证实，F2、AS-ODN组能抑制PDGF-A的表达。这进一步证实了F2通过抑制Egr-1的表达来抑制缺氧诱导的VSMCs的过度增殖。

【文献】
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　　［3］贾强用, 石刚刚, 吕艳秋，等. 碘化N-正丁基氟哌啶醇减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤作用的机制研究［J］. 汕头大学医学院学报, 2006, 19(4): 197-200.

　　［4］周燕琼, 石刚刚, 高分飞, 等. 碘化正丁基氟哌啶醇对大鼠心肌缺血再灌注损伤血流动力学的影响［J］. 药通报, 2004, 20(4): 449-452.

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