对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM
【关键词】 黑色素瘤
Inhibition of lung metastasis of B16 melanoma cells transfected with murine granulocytemacrophage colonystimulating factor in mice
【Abstract】AIM: To investigate the inhibition of lung metastasis of melanoma by a tumor vaccine of B16 melanoma cells transfected with murine granulocytemacrophage colonystimulating factor (mGMCSF). METHODS: The murine melanoma cell line B16 was transfected with the recombinant plasmid containing mGMCSF. A cell line stably expressing mGMCSF was obtained by G418 selection. The Balb/c mice were administered i.v. with B16 cells transfected with or without mGMCSF respectively and the lung metastasis was examined 2 weeks later. RESULTS: The recombinant cell line B16TR was established after mGMCSF tranfection and the expression of mGMCSF was confirmed by RTPCR. The number of lung metastatic lesions of mice treated with B16TR was significantly fewer than that of mice treated with B16 (n=5, 125.8±34.3 vs 27.8±24.0, P<0.01). CONCLUSION: The mGMCSF transfection can significantly suppress the lung metastasis of melanoma in mice. The GMCSF can be a promising adjuvant in the immunotherapy of melanoma.
【Keywords】 melanoma; mice; granulocytemacrophage colonystimulating factor; lung neoplasms/secondary; cancer vaccines
【摘要】 目的： 探讨小鼠粒细胞巨噬细胞－集落刺激因子（mGMCSF）基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果. 方法： 应用脂质体将含有mGMCSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤细胞，经G418加压筛选后，挑选表达mGMCSF基因的B16黑色素瘤细胞. 观察转导或未转导mGMCSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小鼠体内的肺转移. 结果： 转导mGMCSF 基因的B16黑色素瘤细胞可以稳定表达mGMCSF，在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素瘤细胞对照组，二者差异显著（n=5, 125.8±34.3 vs 27.8±24.0, P<0.01）. 结论： mGMCSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的肺转移，提示GMCSF具有黑色素瘤的临床应用前景.
【关键词】 黑色素瘤；小鼠；粒细胞巨噬细胞－集落刺激因子；肺肿瘤/继发性；癌症疫苗
0引言
黑色素瘤是一种恶性程度很高的恶性肿瘤，早期即可发生肺、脑转移. 其发病率有逐渐增高的趋势，然而目前尚无有效的治疗方法［1-3］. 近年来，免疫治疗已经成为黑色素瘤治疗研究的一个热点［2,4-5］，其中，联合细胞因子的肿瘤细胞免疫是一个重要的方向，可以涉及几乎全部与免疫系统相关的细胞因子. GMCSF具有可增强粒细胞、巨噬细胞活性，增强MHCⅠ, MHCⅡ, B7分子的表达，增强抗原提呈功能等广泛的生物学活性，因而可能在肿瘤的免疫治疗中具有着重要作用. 我们拟将GMCSF基因转染黑色素瘤细胞系B16，观察其对黑色素瘤细胞生长及转移的影响，为抗黑素瘤免疫治疗进行有益的尝试.
1材料和方法
1.1材料B16小鼠恶性黑色素瘤细胞系、含有鼠GMCSF基因的真核表达质粒pGEMTeasymGMCSF和E.coli JM109为本室保存. 质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司；RNA提取试剂盒、RNA逆转录试剂盒均为美国Promega公司产品；限制性内切酶、AMV逆转录酶、随机引物均为宝生物公司产品；透析胎牛血清、DMEM培养基、G418,脂质体转染试剂盒均为Gibco公司产品；6～8周龄雄性Balb/c小鼠购自军事医学院实验动物中心.
1.2方法根据mGMCSF序列及pcDNA3.1多克隆酶切位点设计引物，上游: 5′GCTAGCACCATGTAACTGCAGAATTTAC3′,下游5′CTCGAGCTCATT
TTTGGACTGGTTTTT3′. 引物由上海博亚生物工程有限公司合成. 以pGEMTeasymGMCSF质粒为模板,上述mGMCSF基因特异引物按常规方法进行PCR扩增. 将PCR反应产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析. 通过Nucleotrap kit (Clontech)回收阳性PCR产物. 将回收的mGMCSF基因及pcDNA3.1分别用以NheI和EcoRI双酶切,并用T4 DNA连接酶连接后，转化E.coli JM109, 获得重组质粒pcDNA3.1/mGMCSF. 将限制内切酶进行酶切鉴定正确的菌种送上海生工生物技术公司测定DNA序列进行确证.
采用Lipofectin 试剂转染，按其说明书进行转染，同时转染pcDNA3.1空载体作为对照. 挑选阳性克隆进行扩大培养，加压筛选2 mo后进行RTPCR鉴定细胞转染结果. 用Promega 公司RNA提取试剂盒提取、纯化细胞总RNA，进行总RNA纯度分析后，按试剂盒说明进行反转录反应，取反转录的cDNA链为模板进行PCR反应. PCR扩增条件为： 95℃，预变性2 min，继之以32个循环，包括94℃ 1 min, 52℃ 1 min, 72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min. 分别取PCR产物进行10 g/L琼脂糖电泳，紫外线投射仪观察结果并照相.
胰酶消化体外培养的B16细胞，PBS洗3遍，过200目筛网得到单细胞悬液，调整细胞浓度为5×109/L，每只小鼠尾静脉注射0.2 mL， 2 wk后处死小鼠记数肺转移灶个数，设立肿瘤对照组和mGMCSF治疗组.
统计学处理： 结果以x±s表示，各组结果数据应用SPSS11.0统计软件进行t检验.
2结果
2.1pcDNA3.1/mGMCSF表达载体的构建将mGMCSF的PCR扩增产物，插入pcDNA3.1载体，得到重组质粒pcDNA3.1/mGMCSF，用NheI和XhoI双酶切该质粒，可得到430 bp的mGMCSF片段，与预期大小相符（图1）. DNA序列分析结果表明，所插入序列完全正确，表明重组质粒构建成功.
2.2mGMCSF在B16小鼠黑色素瘤细胞中的表达将重组质粒pcDNA3.1/mGMCSF转染小鼠黑色素瘤细胞系B16, 经过G418加压筛选，得到能稳定传代的G418抗性细胞系B16TR. 为了证实该细胞系可表达mGMCSF，我们以转染细胞总RNA为模板，行RTPCR检测，结果显示在该细胞系中可检测到450 bp左右的条带，与mGMCSF的大小相符，提示B16TR中含有并可表达mGMCSF基因(图2).
2.3抑瘤效果分别将1×106个转导了mGMCSF基因的小鼠黑色素瘤细胞B16TR和未转染mGMCSF基因的肿瘤细胞B16，从尾静脉注射小鼠，2 wk后处死小鼠并计数肺部转移灶的数目，可以看出未转染mGMCSF组肺部转移灶弥散，大小不一；而mGMCSF基因转染组肿瘤成瘤性明显下降，表现为肿瘤转移灶的数目和大小明显减少，且有一只未见肿瘤转移灶发生. t检验显示两组转移灶数目具有显著性差异（n=5， 125.8±34.3 vs 27.8±24.0， P<0.01,图 3）. 提示mGMCSF转导可明显抑制黑色素瘤的转移.
3讨论
联合细胞因子用于肿瘤免疫以提高机体的特异性抗肿瘤免疫功能是一个重要的抗肿瘤免疫策略［6-7］. 我们发现，转染GMCSF基因的B16注射后的小鼠肺转移结节数明显少于未经转染的肿瘤对照组，提示经转染有GMCSF的B16细胞的成瘤性降低. 我们推测，由于B16肿瘤细胞内转入GMCSF基因，使细胞因子在肿瘤局部大量产生，激活了杀伤细胞，诱导机体抗肿瘤免疫效应；同时转入GMCSF基因的肿瘤细胞易被机体免疫系统识别，从而提高机体自身免疫功能避免肿瘤逃避免疫监视，启动机体自身主动抗肿瘤能力，最终达到减少肿瘤发生，降低成瘤率的目的. 许多研究结果证实，一些细胞因子可以通过对肿瘤细胞的修饰来改变其免疫原性，从而诱导宿主特异性抗肿瘤免疫效应［3］. 基于这些发现，各种细胞因子基因转染的肿瘤细胞用于的研究应运而生. 到目前为止，这些研究几乎涉及到全部与免疫系统相关的细胞因子［8-9］. 其中GMCSF因具有可增强粒细胞，巨噬细胞活性，增强MHCⅠ，MHCⅡ，B7分子的表达，增强抗原提呈功能等广泛的生物学活性，从而可能在肿瘤的免疫治疗中会发挥重要作用［5,10］.
我们下一步拟探讨转染GMCSF基因的B16对肿瘤小鼠免疫原性的直接影响，为将来联合细胞因子的黑色素瘤临床免疫治疗提供进一步的实验依据.
【】
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