2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究

                     作者：柴可夫 黄晓玲 钱俊文 马纲

【摘要】  目的］从分子水平探讨2型糖尿病湿热困脾证的中医证候实质。［方法］抽取2型糖尿病气阴两虚证患者静脉血，检测血糖，血脂及电解质，分离血液中的白细胞，提取总RNA，化学发光方法检测基因芯片，用ScanAlyze软件采集图像，GEArray Analyzer软件分析数据。对部分差异表达基因进行RT?PCR和Western?blotting方法验证。［结果］2型糖尿病湿热困脾证患者血糖，血脂，电解质与健康人有显著差异，基因芯片检测发现和健康人差异表达基因共38条，其中上调的基因有24条，下调的基因有14条。并发现湿热困脾证的特异性基因。通过RT?PCR和Western?blotting方法反向验证IRS?2和FOXC2基因，证实2型糖尿病湿热困脾证患者和健康人白细胞中存在IRS?2和FOXC2存在差异表达。［结论］应用基因芯片筛选2型糖尿病湿热困脾证的差异表达基因，为2型糖尿病辨证论治提供新思路。

【关键词】  2型糖尿病;基因芯片;辨证分型

　　糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的慢性疾病。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱为主要共同标志。本研究观察糖尿病湿热困脾证的基因表达差异，探讨2型糖尿病湿热困脾证的证候实质。1  临床资料　　1.1  研究对象  对浙江中医药大学附属第二糖尿病防治中心400例糖尿病患者进行中医辨证分型，随机选取6例湿热困脾证患者，其中男性3例，女性3例，年龄30岁至65岁之间，年龄（57.6±7.7）岁。另选取年龄与性别相匹配的健康人6例作对照，平均为（50.8±9.4）岁。健康对照组皆通过血糖检查排除糖尿病，通过病史调查和体检、血象、肝肾功能、胸透、心电图等检查，排除其它内分泌疾病和各系统器质性疾病。

　　1.2  医学诊断标准  根据1999年WHO专家咨询报告诊断标准，空腹血糖（FPG）≥7.0mmol/L(126mg/dl)；或糖耐量试验（OGTT）中服糖后2小时血糖（2HPG）≥11.1mmol/L(200mg/dl)；或随机血糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)。

　　1.3  中医辨证标准  参照2002年版《中药新药临床研究指导原则（试行）》中“中药新药糖尿病的临床研究指导原则”，湿热困脾证,主症：胸脘腹胀，或食后饱满，头身困重。次症：体形肥胖，心胸烦躁，四肢倦怠，小便黄赤，大便不爽。舌脉：舌红苔黄腻，脉滑而数。

　　1.4  病例纳入和排除原则  凡符合现代医学诊断标准和中医辨证标准，可纳入试验病例。排除①有糖尿病急性并发症；②经确诊为1型糖尿病，其它类型糖尿病及妊娠糖尿病者；③年龄在40岁以下或70岁以上，妊娠或哺乳期妇女；④有严重心、肝、肾等并发症，或合并有其它严重原发性疾病，精神病患者。⑤中医辨证症状不典型，或者两型三型并见证型复杂者。

　　2  实验方法

　　2.1  一般情况  测量身高，体重。体重指数（BMI):BMI=体重（kg）/身高（m2）。

　　2.2  生化检测  所有受试对象均于上午8时前空腹抽取肘静脉血10ml，用于测空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白（HbAlc）、胰岛素抵抗指数（ISI=ln［1/(FBS×FINS)］）、血钙、血钾等生化检测。

　　2.3  基因芯片检测

　　2.3.1  白细胞的提取与RNA的纯化  随机选取其中3名湿热困脾证糖尿病患者和3名健康人抽取静脉血5ml，用红细胞裂解液分离白细胞，采用Trizol一步法抽提总RNA，用分光光度计在260nm和280nm分别测定吸光度，A260/A280比值在1.8～2.1为较纯的RNA，可用于芯片检测。

　　2.3.2  芯片杂交  经检测合格后的总RNA可用于合成双链DNA进行纯化。然后进行化学发光检测的Ampo Labeling?LPR标记，变性的c DNA探针全部加入0.75ml预热的GEAprehyb中，混匀，放在60°C待用。弃去杂交管中的GEAprehyb溶液，加入含探针的GEAhyb混合液至杂交管中，60°C下6rpm杂交。

　　2.3.3  化学发光检测  洗膜后加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶（AP），再洗膜4次，加入CDP?Star化学发光底物至杂交管中，室温孵育2min。用滤纸去除多余的CDP?Star溶液，用X射线胶片曝光。

　　2.3.4  图像采集和数据分析  运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，使用芯片配套软件GEArray Analyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。

　　2.4  逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）方法验证部分差异表达基因。

　　2.4.1  引物设计  将RNA反转录合成CDNA，用Primer5软件设计，由上海生物工程技术有限公司合成。

　　扩增引物PrimerbpIRS?2FOXC2β?actin上游5'?TTG AGG CGG CTA AGT CT?3'下游5'?TCC CAGgATgCTgTTgC?3'上游5'?CCT TCT ACCgCG AGA ACA AG?3'下游5'?CCGgGT CGAgCG TCC AGT AG?3'上游5'?ATG CCA TCC TGCgTC TG?3' 下游5'?ACT CCTgCT TGC TGA TCC?3'393520566

　　2.4.2  扩增反应条件：
   
　　FOXC2  94℃5min；94℃30s；60.0℃50s；72℃1min；  72℃5min；共30个循环
   
　　IRS?2  94℃5min；94℃30s；  55.5℃50s；72℃1min；  72℃5min；共30个循环
   
　　β?actin  94℃5min；94℃30s；  55.5℃50s；72℃1min；  72℃5min；共30个循环
   
　　扩增产物取10μl的β?actin和10μl目的基因在1.2%琼脂糖(含EB0.5ng/ml)上电泳，紫外灯下观察结果并照相，吸光度扫描仪扫描后PCR条带用软件进行定量分析，结果为基因表达量对β?actin内参的比值，以上结果重复3次，取平均值。

　　2.5  Western?blotting检测IRS?2蛋白的表达  抽提蛋白、制备PAGE胶、膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。KCTM化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液，将膜置于反应液中室温孵育5min。去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。

　　2.6  统计学分析  各组实验数据以(x±s)表示，采用SPSS Windows13.0软件处理，以One Way ANOVA方法进行方差分析，P<0.05为统计学意义显著性标准。

　　3  结果

　　3.1  糖尿病湿热困脾证临床基本资料间的关系  湿热困脾证组BMI、HbAlc均高于健康对照组，其间差别有统计学意义(P<0.05)，湿热困脾证组ISI显著低于健康对照组(P<0.05)。血脂情况观察发现湿热困脾证的TG水平高于健康对照组（P<0.05）；HDL?C水平低于健康对照组（P<0.01）；LDL?C水平明显高于健康对照组，差别有统计学意义（P<0.05）。湿热困脾证患者血清钙、血钾均低于健康对照组（P<0.05），见表1、表2、表3。

　　表1  糖尿病湿热困脾证与健康对照组BMI、HbAlc、ISI的比较（略）

　　与健康组比较,*P<0.05,#P<0.01

　　表2  糖尿病湿热困脾证与健康对照组TG、HDL?C、LDL?C的比较（略）

　　与健康组比较，*P<0.01

　　表3  糖尿病湿热困脾证与健康对照组BMI、HbAlc、ISI的比较（略）

　　与健康组比较，*P<0.01

　　3.2  基因芯片检测结果

　　3.2.1  总RNA提取结果  总RNA紫外分光OD26/OD28在1.8～2.0之间，提取的总RNA28S、18S rRNA亮而浓条带清晰，RNA样品电泳条带清晰，28S比18S条带的亮度接近2∶1，质量符合分类表达谱芯片实验要求，总RNA质量完整无降解。

　　3.2.2  湿热困脾证糖尿病患者的基因表达研究　湿热困脾证糖尿病患者与健康对照组相比，共筛选出表达量改变比值大于2倍的基因38条，其中表达上调的基因有24条，包括受体、载体通道基因5条；分泌基因5条；信号转导基因2条；转录因子基因7条；代谢酶基因5条。表达下调的基因有14条，包括代谢酶基因2条；信号转导基因6条；受体、载体通道基因3条；转录因子基因1条；未知基因1条，见图1、表4、表5。

　　湿热困脾组健康对照组

　　图1  化学发光法Super Arrary芯片图（略）

　　表4  糖尿病湿热困脾证与健康对照组相比表达上调基因（略）

　　表5  糖尿病湿热困脾证与健康对照组相比表达下调基因（略）

　　3.3  部分差异基因的验证

　　3.3.1  荧光定量PCR检测结果  结果显示，两条基因表达均与芯片结果相符合，其中FOXC2（Forkhead box C2）在湿热困脾证中表达为上调；IRS?2（Insulin receptor substrate 2）在湿热困脾证中表达为下调，见图2、图3、表6。

　　3.3.2  Western?blotting检测结果  结果显示IRS?2蛋白表达与基因芯片结果相一致，在湿热困脾证中表达减少，见图3。

　　M.DNA Marker；1.健康对照组；2.湿热困脾组

　　图2  糖尿病湿热困脾证与健康人IRS?2、FOXC2和内参照基因β?actin mRNA表达（略）

　　1.湿热困脾组  2.健康对照组

　　图3  糖尿病湿热困脾证和健康对照组IRS?2蛋白表达（略）

　　表6  2型糖尿病湿热困脾证与健康人IRS?2、FOXC2 mRNA及IRS?2蛋白的表达（略）

　　与糖尿病组比较，*P<0.01

　　4  讨论
   
　　2型糖尿病属于中医“消渴”的范畴。病因为长期食用肥甘厚腻之品，而致湿热中阻，久而发为消渴。肥胖是湿热困脾型2型糖尿病的重要因素，故湿热困脾证糖尿病患者体重指数较高，肥胖往往伴随胰岛素抵抗，本项研究显示：湿热困脾证的ISI指数显著低于健康人，提示存在胰岛素抵抗。湿热困脾证糖尿病患者的血糖、血脂及电解质水平均高于健康对照组；糖尿病患者基因表达与健康人比较，差异表达基因有38条，差异基因总体呈上调趋势。这些基因与肥胖、胰岛素抵抗、早期糖尿病及糖尿病的各种并发症有关。
   
　　IFN?γ属于分泌因子相关基因，是一种由活化T细胞产生，具有抗病毒、抑细胞生长及刺激中性粒细胞及血管内皮细胞生长的生理功能。过去已有多项研究表明：自身免疫性疾病患者的血清干扰素(INF)反应异常。淋巴细胞产生的IFN?γ介导单核细胞与T淋巴细胞之间的对话。目前认为不仅1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，而且2型糖尿病的发病也与机体的免疫功能密切相关。2型糖尿病是在遗传基础上由多因素促成的，患者有免疫异常，其胰岛细胞抗体(ICA)阳性者比ICA阴性者有更严重的β细胞损害［1］。IFN?γ能显著抑制胰岛素的分泌，促进胰岛β细胞凋亡［2］。本研究中，基因芯片结果中糖尿病湿热困脾证患者的IFN?γ表达上调，显著高于健康对照组，表达差异在2倍以上。L选择素（Selectin L,SELL）属于受体、载体及其通道基因，是黏附分子选择素家族的成员之一。近年的研究显示L?选择素与糖尿病血管病变的发生密切相关［3］，L?选择素介导的活化血小板与内皮细胞、白细胞的黏附，相互作用，释放活性物质，如血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等，促进血管平滑肌增生、结缔组织生成，最终导致动脉粥样硬化的形成［4］。本研究中，糖尿病湿热困脾证患者的L选择素的表达显著高于健康对照组，可能与2型糖尿病患者伴有不同程度血管病变的并发症有关。IRS?2蛋白(Mr 180 000)最初是从骨髓组织中提纯分离，称为4PS，因与IRS?1有高度保守结构和一些共同功能，后定名为IRS?2［5］。已证明IRS?2的表达下降有助于2型糖尿病的形成。造成IRS?2表达下降的原因包括基因启动子或增强子的突变，这使转录速度减小；还包括造成mRNA稳定性或转录效率下降的突变等。
   
　　本项研究中发现有5条特异性下调表达基因，仅存在于湿热困脾证中，而在其他证型中未见有异常表达。它们分别是：CCR2、INPPL1、AKT2、CEACAM1、NFKB1，这些基因均与2型糖尿病的发生和发展有密切的联系，本项目研究结果进一步证实它们与湿热困脾证有内在的联系。
   
　　通过对糖尿病湿热困脾证的基因组学研究，深化了对“湿热困脾证”本质的理性认识，将宏观现象的研究与微观机理的探讨很好的结合，中医辨证施治侧重于宏观调控，对微观的揭示还不那么精确，诊断疾病的依据往往显得较为笼统，因而影响了“治未病”的普及运用。基因表达谱是从mRNA水准反映了细胞或组织特异性表型和表达模式，与临床上出现的症状和体征有着必然的内在联系，根据基因芯片结果提供的依据，不难预见糖尿病的发生发展，从而给出确切的基因方案，这些都将在一定程度上提高糖尿病的治疗效果。

【】
  1］ Gonzalez?Alvaro I，Dominguez?JimenezC，OrtizAM,et al.Interleu?kin?15 and IFN?γparticipate in the cross?talk between natural killer and monocytic cells required for tumour necrosis factor production［J］.ArthritisResTher，2006，8(4): R88.

　　［2］ Aiello CP.Endothelialgrowth factor induced retinal permeability is mediated by an orally effective β?isoform?sdection inhibitor［J］.Diabetes,1997,40:1473.

　　［3］ HafeziMoghada A,Thomas KL,Prorock A,et al.L?selectin shedding regulates leukocyte recruitment［J］.JexpMed,2001,193(7):863?872.

　　［4］ LIU LH,LI J,ZHANG XY.Relationship between levels of circulation ICAM?1,VCAM?1，L?selectin and cardiovascular diseases with OSAS［J］.Zhongguo Xiandai Yixue,2002,12(7):4.

　　［5］ KIRSTEN F，HOWLETT，KEI Sakamoto，et al.Insulin signaling after exercise in insulin receptor substrate?2?deficient mice［J］.Diabetes,2002,51(2):479?483.