鄂产魔芋中葡甘露聚糖的含量测定
【摘要】 目的 优化3，5-二硝水杨酸（DNS）比色法检测魔芋葡甘露聚糖并测定鄂产魔芋中葡甘露聚糖的含量。方法从葡甘露聚糖的提取方法、检测波长、显色时间、DNS添加量、水解酸度和水解时间几个方面优化DNS比色法，利用优化后的DNS比色法测定了我省五峰、长阳、利川和南漳等地的魔芋中葡甘露聚糖含量。结果魔芋精粉、二级精粉、长阳产魔芋、利川产魔芋和南漳产魔芋中葡甘露聚糖含量分别为72.84%,65.25%,49.12%,50.70%和40.77%。结论不同产地的鄂产魔芋中葡甘露聚糖含量有一定的差异，为今后开发利用提供了依据。
【关键词】 魔芋； 葡甘露聚糖； 3,5-二硝基水杨酸
Abstract:ObjectiveTo optimize 3,5-dinotrosalicy (DNS) colorimetry and determine the content of konjac glucomannan in Hubei province.MethodsThe 3,5-dinotrosalicy (DNS) colorimetry was optimized from extraction, wavelength, reaction time, dosage of DNS, acidity and time of hydroolyze. The content of konjac glucomannan in Hubei province was determined by the optimized method.ResultsThe content of Konjac glucomannan from Wufeng, Changyang, Nanzhang, Lichuan was 72.84%,65.25%,49.12%,50.70% and 40.77% respectively.ConclusionThe content of konjac glucomannan is different from place to place, which is valuable for the future utilization and exploitation.
Key words:Konjac； Glucomannan； 3，5-dinotrosalicy
魔芋原植物名为Amorphophallus rerieri，又称蒟蒻，属单子叶植物纲，天南星科耐荫性多年草本植物。全世界大约有170种，主要分布在亚洲和非洲。我国魔芋资源丰富，有20多种，其中至少13种为我国所特有，是世界上魔芋精粉最大的出口国。据不完全统计，我国每年生产魔芋约70～80万t。魔芋的球茎中主要含有葡甘露聚糖（Konjac Glucomannan，KGM）、淀粉、生物碱、纤维素和矿物质等［1］，其中KGM是其生理活性主体，它是由葡萄糖和甘露糖通过β-（1-4）糖苷键和β-（1-3）糖苷键［2］连接而成的高分子多糖。近年来，国内外研究证实，KGM是一种优良的低热量、低脂肪、高纤维素的水溶性膳食纤维，对营养不平衡有重要调节作用。诸多学者研究表明，KGM具有降血糖，降血脂及逆转脂肪肝、通便减肥、抗癌、增强免疫功能、抗衰老等［3］保健作用和医疗功效。
目前，KGM含量测定方法已有一些报道，一般通过酸完全水解KGM后，再以费林滴定法、重量法［4］、分光光度法［5～7］、旋转粘度法［8］、薄层色谱法［9，10］、气相色谱法［11］和高效液相色谱法［12，13］进行测定，每种方法都有各自的优缺点。其中分光光度法既不需要昂贵的大型分析仪器，结果准确度又高，而且可应用于大型生产。依据［14］，DNS比色法是魔芋葡甘露聚糖测定较为理想的方法之一。而DNS比色法中KGM提取方法以及显色时间、水解酸度等因素对KGM的含量测定也有很大的影响，因此，寻求一种最精确、最简单、最快速的测定魔芋葡甘露聚糖的方法十分必要。
1 仪器与试剂
1.1 材料
魔芋豆腐、魔芋精粉（五峰杰成魔芋有限公司提供）、生魔芋（长阳、利川、南漳产）。
1.2 仪器
721分光光度计（上海泰益医疗仪器设备有限公司）、S-1100紫外可见分光光度计（韩国新科公司）、85-2恒温加热磁力搅拌器（杭州仪表电机有限公司）、微型台式高速离心机5415D（德国eppendof公司）、KQ5200B型超声波清洗器（宁波荣顺科技仪器厂）、FW177型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、电热恒温鼓风箱（上海精宏实验设备有限公司）、AL201天平（Mettle-Toledo）、水浴锅（上海跃进医疗器械厂）。
1.3 试剂
DNS，乙醇，硫酸，葡萄糖，甲酸，氢氧化钠，亚硫酸氢钠，酒石酸甲钠，乙醚，石油醚等购自试剂公司，均为分析纯。
1.4 DNS配制称取10 g 3,5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入20 g NaOH，20 g酒石酸钾钠和500 ml水，加热溶解后再加入重蒸酚2 g，无水亚硫酸钠0.5 g，待全部溶解后冷却，定容至1 000 ml，过滤，滤液于棕色试剂瓶中，放置1周后使用。
2 方法
2.1 KGM的提取
文献报道［15，16］魔芋葡甘露聚糖的提取方法有乙醇沉淀法、酸性冷溶法、沸水溶解法和直接酸解法，本文使用同一种魔芋材料，选择常用的3种提取方法，即水提法、超声波提取法和甲酸-氢氧化钠缓冲液溶胀法，在495 nm处测定吸光度，常规方法出KGM的含量。结果见表1。
从表1可以看出，甲酸-氢氧化钠缓冲液溶胀法提取效率最高，与其它两种方法相比具有显著差异。比超声波提取法和常规水提法所提取的KGM含量分别高5.78%和10.43%。并且从操作过程看，甲酸-氢氧化钠缓冲液溶胀法简单快速，它省去了常规法、超声水提法中用85%乙醇除去游离还原糖的操作。虽然魔芋粉中的游离还原糖也能与DNS显色，但通过试样空白（T白）对照可将其从实验结果中扣除。
2.2 标准曲线
按文献［15］方法, 分别取浓度为1.0 mg·ml-1标准葡萄糖工作液0.00，0.40，0.80，1.20，1.60，2.0 ml于6个25 ml容量瓶中，再分别加1.5 ml DNS试剂，摇匀，沸水浴中加热5 min，立即冷却，定容至刻度。用1 cm比色皿比色，以空白对照溶液调零点。在全波长范围内进行扫描，并在常用的4种波长下建立葡萄糖紫外分光光度法标准曲线，结果表明在505 nm处有最大吸收峰，且线性关系最好。结果见表2。表1 3种提取方法结果比较（略）表2 不同波长下葡萄糖标准曲线的回归方程和相关系数（略）
2.3 显色时间的影响
按照文献［16］的方法制备KGM水解液，分别取2 ml加入到8只比色管中，再分别加入1.5 ml DNS，在沸水浴上水解不同的时间，然后在505 nm测定其吸光度值。结果表明DNS与还原糖反应的显色时间达5 min时趋向平衡。
2.4 DNS添加量的影响
取KGM水解液2 ml加入到8支比色管中，然后分别加入不同体积的DNS，在沸水浴上水解1.5 h，505 nm处测定其吸光度值。实验结果表明，DNS添加量为1.5 ml时显色反应完全。
2.5 魔芋葡甘露聚糖水解酸度的影响
取6支25 ml比色管，分别加入1 ml KGM提取液和不同浓度的H2SO4溶液0.5 ml，沸水浴中水解1.5 h，505 nm处测定其吸光度值。结果表明水解液中酸度为2N时魔芋中葡甘露聚糖已经完全水解。
2.6 魔芋葡甘露聚糖水解时间影响
取6支25 ml比色管，准确加入1.0 ml魔芋甘露聚糖KGM提取液，分别加入3 mol·L-1 H2SO4 溶液0.5 ml。依次按不同时间在沸水浴中水解，505 nm处测定各水解时间t下溶液的吸光度值，结果表明沸水浴中水解1.5 h时魔芋葡甘露聚糖即可完全水解。
2.7 鄂产魔芋葡甘露聚糖含量的测定
2.7.1 葡萄糖标准曲线的绘制按“2.2”所述的方法，在505 nm处测定标准葡萄糖的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程为 y=24.006 9x-0.104 5，r= 0.999 6。结果见表3。表3 505 nm处不同浓度标准葡萄糖溶液与吸光度的关系（略）
2.7.2 样品预处理将魔芋洗净，切成厚度为1 cm的小块，放入电热恒温鼓风箱中预干燥4 h，温度为80℃，再切成3 mm厚的小块，继续干燥7.5 h，将烘干的魔芋粉碎，过80目筛，即得魔芋粉。
2.7.3 KGM提取液制备
取魔芋粉200 mg，置150 ml烧杯中，加100 ml 0.1 mol·L-1甲酸-氢氧化钠缓冲溶液（pH 3～3.2），在30℃时搅拌2 h，放置过夜。将已溶胀的葡甘露聚糖溶液离心，以4 000 r/min离心30 min，移取上清液，即得到KGM提取液。
2.7.4 KGM水解液的制备
分别取2 ml KGM提取液于3个25ml具塞比色管中，加入0.5 ml 3 mol·L-1硫酸溶液，在沸水浴中水解1.5 h，取出冷却。准确加入2.5 ml 6 mol·L-1 氢氧化钠溶液，摇匀，用蒸馏水定容，即得KGM水解液。
2.7.5 KGM检测液的制备
分别取KGM提取液2 ml加入3支25 ml具塞比色管中，分别取KGM水解液2 ml加入3支25 ml具塞比色管中，另取1支25 ml具塞比色管中加入2 ml蒸馏水。在7支比色管中分别加1.5 ml DNS试剂，摇匀，沸水浴中加热5 min，立即冷却,然后用蒸馏水定容至刻度，即得KGM检测液。
2.7.6 KGM的含量测定
测定KGM检测液在505 nm处的吸光度值，依下式各样品中KGM的含量：
KGM（%）=ε（255T样-T白）×1002 m×100%
上式中ε—0.9，为甘露糖和葡萄糖在葡甘露聚糖分子中的残基分子量与葡甘露聚糖水解后得到的甘露糖和葡萄糖分子量之比：
T样—水解液的吸光度值
T白—水解液的吸光度值
m—魔芋粉样品重（mg）
3 结果与分析
对五峰杰成魔芋有限公司提供的魔芋特级精粉和二级精粉以及长阳、利川、南漳三地产魔芋利用上述方法进行多次测量，得出魔芋的KGM含量。结果见表4。表4 鄂产魔芋葡甘露聚糖含量（略）
3.1 回收率测定
按上述方法制备KGM检测溶液，直至水解完成，用6 mol·L-1氢氧化钠中和，在2支比色管中精密加入10 mg·ml-1的葡萄糖对照溶液0.5 ml，另一支比色管中不加葡萄糖，再用蒸馏水定容至25 ml，即得水解液。检测各自在505 nm处的吸光度T，其平均回收率为98.05%。结果见表5。表5 回收率实验结果（略）
3.2 精密度实验
选三组魔芋样品，利用甲酸-氢氧化钠溶胀提取法，多次平行实验结果表明，其标准偏差为0.09～0.26，变异系数为0.26%～0.67%。结果见表6。表6 精密度实验结果（略）
4 结论
本实验结果表明，甲酸-氢氧化钠缓冲液溶胀法提取KGM提取效率高而且结果可靠，此法减少了去还原糖的步骤并且独特的定容方法避免转移过程中容器壁上附着KGM，从而使测定结果更加准确，实验重现性高。另外，此法较其它方法用时少，操作简单。
从报道看，利用分光光度法测定魔芋葡甘露聚糖含量时，其吸收波长各异。本文利用紫外可见分光光度计在全波长扫描，得出葡萄糖在505 nm处有最大的吸收峰，且线性关系最好。
对实验的优化条件摸索后，最终得出葡甘露聚糖含量测定的最佳方法：用0.1 mol·L-1甲酸-氢氧化钠缓冲溶液（pH 3～3.2）溶涨魔芋粉，在30℃时搅拌2ｈ，放置过夜。以4 000 r/min离心30 min，得到KGM提取液。加入0.5 ml 3 mol·L-1硫酸溶液，在沸水浴中水解1.5 h，冷却，加入2.5 ml 6 mol·L-1 氢氧化钠，摇匀，定容，即得KGM水解液。分别取KGM提取液和KGM水解液2 ml加入2只25 ml具塞比色管中，另取1只25 ml具塞比色管中加入2 ml蒸馏水。分别加1.5 ml DNS试剂，摇匀，沸水浴中加热5 min，立即冷却后定容，在505 nm处测定其吸光度。
优化后本实验方法的回收率为98.05%，标准偏差为0.09～0.26，变异系数为0.26%～0.67%。综上所述可知，优化后的实验方法具有简单、快速、、高效等特点。
利用上述优化后的葡甘露聚糖含量测定方法，对鄂产魔芋进行了葡甘露聚糖含量测定，可知不同产地的魔芋其KGM的含量有一定的差异，为今后开发利用提供了科学依据。
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