葛根素衍生物4ac混悬液及其纳米粒在Beagle犬体内的药代动力学研究

                           作者：郭东艳 陈士林 杨大坚

【摘要】  　　目的比较葛根素衍生物4ac混悬液及其纳米粒在Beagle犬体内的生物利用度。方法分别于给药后不同时间取血，高效液相色谱（HPLC）法测定血清中葛根素衍生物4ac的血药浓度，应用3P97药动学统计软件对血药浓度数据拟合。结果葛根素衍生物4ac混悬液及其纳米粒在Beagle犬体内过程均符合二室开放模型。结论葛根素衍生物4ac纳米粒较葛根素衍生物4ac混悬液相比能明显提高在Beagle犬体内的生物利用度。

【关键词】  葛根素衍生物4ac； 药物动力学； 高效液相色谱

　　Abstract：ObjectiveTo study the pharmacokinetics of  suspension  and  nanopaticles  in  beagle dogs.MethodsBlood was collected at different time. The plasma concentration of the derivatives-4ac was determined by HPLC. The compartment model was calculated with 3p97 program  and  the pharmacokinetic parameters were compared with SPSS program. ResultsThe  suspension and nanopaticles of derivatives-4ac could be fitted to two-compartment model in beagle dogs. ConclusionNanopaticle of derivatives-4ac can obviously improve the bioavailability in beagle dogs.

　　Key words：Derivatives-4ac；  Pharmacokinetics ；  HPLC
   
　　葛根素是葛根心脑血管活性的主要物质基础［1，2］，临床上常用于冠心病、心绞痛及脑血栓等疾病［3～5］。实验证明，犬口服葛根素的生物利用度低，其绝对生物利用度约为3%，大部分以原形从粪便中排出。为了提高葛根素的生物利用度，制备了葛根素的衍生物4ac及其衍生物4ac的纳米粒。本实验旨在采用高效液相色谱法，测定葛根素衍生物4ac混悬液及其纳米粒在Beagle犬体内的生物利用度。

　　1  器材

　　1.1   药品与试剂葛根素衍生物4ac由香港理工大学杨大坚教授提供，经HPLC法测定含量均在98%以上。葛根素衍生物4ac混悬液为4ac加蒸馏水制成的混悬型水针剂；葛根素衍生物4ac纳米粒冻干针剂（4ac-PLA-NP，香港理工大学中药研究所自制）为衍生物4ac经溶剂挥发法制备的纳米胶体溶液经冷冻干燥制成的冻干粉针剂。 乙腈、甲醇均为HPLC级，水为重蒸馏水。

　　1.2   仪器与色谱条件Agillent1100高效液相色谱仪，DAD二极管阵列检测器，HP1100色谱工作站；Agillent  XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；预柱为Agillent XDB-C18柱（4.6 mm×12.5 mm ，5 μm）；梯度洗脱：0 min 乙腈∶水（10∶90） 0.7ml/min；15 min乙腈：水（60∶40）0.7 ml/min；20 min 乙腈∶水（70∶30） 0.7 ml/min；30 min 乙腈∶水（100∶0） 0.7 ml/min；柱温为室温；检测波长为250 nm。

　　1.3   动物Beagle犬，体重（10±0.1）kg，雌雄兼用，由广州医药研究院Beagle犬培育中心供应。

　　2  方法与结果

　　2.1  葛根素衍生物4ac纳米粒（4ac-PLA-NP)的制备称取聚乳酸100 mg，4ac30 mg，卵磷脂0.2 ml（预先用二氯甲烷配成25％的溶液），加入1 ml二氯甲烷中溶解，作为有机相；另取普流罗尼克68（F-68）300 mg溶于蒸馏水中，作为连续相；将有机相加入连续相中，搅拌除去有机溶剂即得。

　　2.2  样品采集取Beagle犬6只，随机分为两组，每组3只，实验前禁食12 h， 4ac混悬水针剂、4ac-PLA-NP冻干针剂分别按含4ac 6 mg/kg静脉注射给药，于给药后0，0.083，0.25，0.5，1.0，3.0，6.0，12，24， 48，72，96，144 h取血，静置30 min后离心，取上层血清备用。

　　2.3  样品处理精密吸取0.5 ml血清，加入甲醇2.0   ml，旋涡振荡1 min，离心15 min（3 000 r/min），上清液用氮气流吹干，残渣加0.2 ml甲醇溶解，离心10 min（10 000 r/min），取上清液进样。

　　2.3.1  色谱条件葛根素对照品液、空白血清、含药血清经处理后的溶液的HPLC色谱图见图1～3。由图可见血清中内源性杂质对葛根素的测定无干扰，葛根素的保留时间为8.3 min。

　　2.3.2  标准曲线制备称取葛根素对照品适量，用甲醇溶解，制成每毫升约含0.1 mg的溶液，作为贮备液。精密吸取此贮备液用甲醇稀释为含葛根素为18.75，12.5，9.375，6.25，3.125 μg/ml的系列标准液。分别吸取以上标准溶液0.5 ml，加入空白血清0.5 ml，按样品处理方法进行处理，得一系列对照品溶液。分别吸取以上系列对照品溶液20 μl，进样测定峰面积。以葛根素浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得葛根素对照品在血液中的标准曲线，其回归方程为A=149 750C-55.665  （r=0.996 3），在0.156 3 ～0.937 5μg范围内线性关系良好。由于回归方程中b/a＞＞100，因此采用外标一点法定量。

　　2.3.3  回收率实验取0.5 ml空白血清6份，分别加入不同量的葛根素对照品溶液，旋涡混合均匀，分别加入甲醇2.0 ml，旋涡振荡1 min，离心15 min，3 000 r/min，上清液用氮气流吹干，残渣加0.2 ml甲醇溶解，离心10 min，10 000 r/min，取上清液进样。记录峰面积，求回收率。高、中、低浓度的平均回收率为96.58%。结果见表1。

　　表1  回收率实验（略）

　　结果表明，回收率在要求范围内, 该方法合理、可行。

　　2.3.4  精密度实验取含葛根素的血清样品0.5 ml，加入甲醇2.0 ml，旋涡振荡1 min，离心15 min（3 000 r/min），上清液用氮气流吹干，残渣加0.2 ml甲醇溶解，离心10 min（10 000 r/min），取上清液进样。采用外标一点法，求RSD（％）。结果见表2～3。

　　表2  日内精密度（略）

　　表3  日间精密度（略）

　　结果表明，日内及日间精密度均<10%，该方法的精密度良好。

　　2.4  数据分析按“2.3”样品处理方法项下对各样品进行处理，进样，采用外标一点法计算出各样品的血药浓度，将测得的血药数据输入计算机，用3P97药动学统计程序处理，结果表明游离4ac及其纳米粒的体内过程均符合二室开放模型。其主要药动学参数见表4。

　　表4  4ac混悬液及其纳米粒主要药动学参数（略）

　　从表4数据直观来看，纳米粒在体内血药浓度与时间曲线下的面积远远高于4ac混悬液组，经t检验， 4ac混悬液与纳米粒组比较有极显著性差异（t<0.01）。

　　图1  空白血清色谱图（略）

　　图2  血液样品色谱图（略）

　　图3  葛根素色谱图（略）

　　3  讨论
   
　　在进行含量测定中发现，血清样品中，4ac在Beagle犬体内主要以葛根素的形式存在，分析其原因可能是由于衍生物在犬体内水解，脱乙酰基而成为葛根素的缘故。因此，含量测定中采用葛根素为对照品进行含量测定。
   
　　由于葛根素衍生物4ac的脂溶性较强，制备成注射液时需要大量的增溶剂；为此制备了葛根素衍生物4ac的纳米粒，旨在提高其生物利用度，通过Beagle犬体内的生物利用度比较实验可以看出，制成纳米粒后其生物利用度明显提高。分析其主要原因在于消除半衰期明显延长，增加了药物在体内吸收的缘故。

【】
  　　［1］ 高秀荣，王春梅，秦桂云，等.葛根素注射液改善冠心病微循环的临床观察［J］.微循环，2002，6（4）：216.

　　［2］ 许旭伟，李进禧，汪 涛，等.葛根素对新生大鼠脑细胞内钙超载的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2003，1（2）：74.

　　［3］ 祝 星，鱼运寿，李仁君，等.葛根素对冠心病患者心肌缺血的疗效［J］.第二军医大学学报，2003，24（3）：343.

　　［4］ 邓晓尧.葛根素不稳定型心绞痛疗效观察［J］.海南医学，2003，14（1）：14.

　　［5］ 任 丽.葛根素治疗脑梗死30例疗效观察［J］.上海中医药杂志，2002，36（1）：20.