高效液相色谱法测定高良姜中二苯基庚烷A的含量

                         作者：周改莲，姜建萍，刘凡凡，辛宁

【摘要】  　　目的测定高良姜中活性成分二苯基庚烷A含量。方法高效液相色谱（HPLC）法；Elite，Hypersil ODS 25 μm (4.6 mm×250 mm)；检测波长210 nm；柱温30℃；流动相为乙腈-0.1%磷酸水（40∶60）；流速1 ml/min。结果二苯基庚烷A的线性范围0.45～3.6 μg，r=0.999 93，回收率99.62%，RSD 1.53%。结论该方法简便，线性关系良好，可作为高良姜中二苯基庚烷A分离检测的一种依据。

【关键词】  高效液相色谱； 高良姜 二苯基庚烷A

　　Abstract：ObjectiveThe purpose is to determine the content of 5 - hydroxyl -7- (4"- hydroxyl -3"- methoxyphenyl ) -1-pheny-3-heptanone from Alpinia officinarum Hance. MethodsThe HPLC was used to determine the content of 5 - hydroxyl -7- (4"- hydroxyl -3"- methoxyphenyl ) -1-pheny-3-heptanone from Alpinia officinarum Hance, the analysis was carried out on Elite Hypersil ODS 25 μm (4.6mm×250mm), the mobile phase was Acetonitrile-0.1%H3PO4(40:60), flow-rate 1.0ml/min and wavelength was 210nm, the colum temperature was 30℃.ResultsThe linear range of 5 - hydroxyl -7- (4"- hydroxyl -3"- methoxyphenyl)-1-pheny-3-heptanone was 0.45～3.6 μg and correlation(r) was 0.999 93,recovery was 99.62% and RSD was 1.53%.ConclusionThe method is simple and presents a good linear relationship, so it can be used to determine the content of 5-hydroxyl-7-(4"-hydroxyl-3"-methoxyphenyl)-1-pheny-3-heptanone from Alpinia officinarum Hance.

　　Key words：HPLC;   Alpinia officinarum Hance;   5?hydroxyl?7-(4"?hydroxyl ?3"?methoxyphenyl ) ?1?pheny?3?heptanone
   
　　高良姜为姜科山姜属(Alpinia)植物高良姜Alpinia officinarμm  Hance的干燥根茎。别名良姜、小良姜、贺哈，始载于《名医别录》，列为中品，因出于高良郡（今广东省湛江地区的茂名市一带）故名，广东省徐闻县人工栽培高良姜已有一百多年的，被认定为道地药材。本品性热味辛，归脾、胃经，具温胃散寒、消食止痛的功效，用于脘腹冷痛、胃寒呕吐、嗳气吞酸等［1］。二苯基庚烷类作为高良姜中的活性成分之一，具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗氧化等药理作用。其中二苯基庚烷A通过抑制前列腺素合成酶而起到镇痛抗炎作用，另外具有抗氧化、改善心血管系统等药理活性［2，3］，但目前还未见有关其含量测定的报道，本文采用HPLC法测定高良姜中二苯基庚烷A的含量，为其今后的质量控制研究提供一种依据，以便更好地开发利用高良姜资源。

　　1   材料与方法

　　1.1    样品药材购自广西南宁和广东徐闻两地，经广西中医学院生药教研室廖月葵鉴定均为姜科山姜属植物高良姜Alpinia officinarμm Hance的根茎。药材洗净，切段，晒干，粉碎，过4号筛，置干燥器中备用。

　　1.2    仪器与试药  Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）：紫外检测器，Agilent化学工作站，色谱柱为大连依利特柱，Hypersil ODS 25 μm (4.6 mm×250 mm)；BP211D分析天平(德国赛多利斯公司)；Millipore simplicity-185超纯水器（美国密理博公司）；KQ-200VDB型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； 0.45 μm微孔滤膜（德国MEMBRANA公司）；微量取液器（北京表云仪表有限公司）。乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）、石油醚（分析纯，北京长海化工厂）、95%乙醇（分析纯，上海试一化学试剂有限公司）。二苯基庚烷A对照品（天津药物研究所提供），水为高纯水。

　　1.3  方法  

　　1.3.1   对照品溶液的制备  取二苯基庚烷A对照品，精密称定，加乙腈溶解，分别制成浓度为0.045，0.060，0.090，0.180，0.360  mg/ml的溶液，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤于高效液相进样瓶中，即得。

　　1.3.2   供试品溶液的制备  取高良姜粉末，约1 g，精密称定，置150 ml三角瓶中，加石油醚（60～90℃）50 ml，超声提取15 min，过滤，弃去石油醚液，药渣蒸干，加95%乙醇50 ml超声提取3次，30 min/次，合并3次滤液，浓缩后定容至50 ml，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤于高效液相进样瓶中，作为供试品溶液。以上超声功率为60%，频率为45 kHz。

　　1.3.3   色谱分析条件  色谱柱为大连依利特柱，Hypersil ODS 25 μm(4.6 mm×250 mm)；检测波长210 nm；柱温30℃；流动相为乙腈-0.1%磷酸水（40：60）；流速1 ml/min。

　　1.3.4   对照品的纯度检查 按上述色谱条件，照2005年《药典》一部附录ⅥD，用面积归一化法测得对照品纯度高于98.3%。

　　2  结果

　　2.1    线性关系的考察  取“1.3.1”项中不同浓度的对照品溶液各进样10 μl，按上述色谱条件测定，结果如表1。色谱峰和标准曲线见图1～2。

　　表1  对照品线性关系（略）

　　图1  对照品图谱（略）

　　图2  对照品标准曲线（略）
   
　　以对照品浓度（μg/μl）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=34 255.74X+72.40,r=0.999 93；表明二苯基庚烷A在0.45～3.6 μg之间呈良好线性关系。

　　2.2    精密度实验  取下述“2.3”项重复性实验中1号供试品溶液进样10μl，按上述色谱条件，重复测定6次，测得对照品峰面积见表2。

　　表2  精密度实验（略）

　　2.3    重复性实验  取同一批样品6份，按上述供试品溶液方法处理，各进样10 μl，以上述色谱条件测定。结果见表3。

　　表3  重复性实验（略）

　　2.4    稳定性实验  取上述“2.3”项中1号供试品溶液，分别于0.5，1，6，8，12，24h测定。结果见表4。

　　表4  稳定性实验（略）

　　平均值为2 551.3，RSD为0.52%，说明样品至少在24 h内是稳定的。

　　2.5    加样回收率实验  取与重现性实验同一批样品6份，每份约0.5 g，精密称定，分别加入对照品1.5 mg，按供试品溶液方法处理，以上述色谱条件进样10 μl测定。结果见表5。
　　
　　表5  加样回收率实验（略）

　　2.6    高良姜的含量测定  将从广西南宁采回的新鲜药材分为两部分，其中一部分直接晒干，称生晒品，另一部分在烘箱中烘干，称烘制品；广东徐闻的是直接购回的生晒品，各取约1 g,精密称定，按供试品溶液方法处理，各进样10 μl，依上述色谱条件测定。结果见表6。

　　表6  样品含量测定结果（略）

　　表6说明不同产地的高良姜二苯基庚烷A含量有差别，但同是广西南宁产的生晒与烘制差别不大。

　　3    讨论
   
　　二苯基庚烷A在210 nm处有最大吸收，其次为281 nm，但同一浓度进样体积相同的该物质在281 nm处的峰面积只有210 nm处的十分之一左右，且以281 nm为测定波长时样品中其它物质峰面积相对要高出许多；选210 nm为测定波长时样品中该物质峰保留时间在11 min 左右，分离度不低于1.5，理论塔板数不少于10 000，故选210 nm为测定波长。
   
　　广东徐闻长期以来都被作为高良姜的道地药材产地，通过本实验可以看出广西南宁产的高良姜在活性成分二苯基庚烷A的含量上要高于广东徐闻产的。周漩等［4］研究发现广西与广东产的高良姜在挥发油总体含量上相似。李彩君等［5］研究表明在高良姜的专属性成分高良姜素的含量上广西梧州的不低于广东徐闻的。由此可知广西亦适合高良姜的生长，现广西南宁已有上百亩的高良姜种植基地，这打破了长期以来广西产高良姜以野生为主的局面，保证高良姜药用资源的同时也在一定程度上推动了广西的。
   
　　双苯庚烷类化合物作为山姜属植物的主要有效成分，具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗氧化等广泛的药理作用。目前关于高良姜中二苯基庚烷类化合物分离纯化及含量测定的报道不多。为了更好地开发利用高良姜资源，我们应加强其单体分离、纯化、含量测定尤其是药效学方面的研究。

【】
  　　［1］ 国家药典委员会.药典，Ⅰ部［S］. 北京: 化学出版社, 2005:202.

　　［2］ 沈 健, 张虎翼, 徐 波, 等. 高良姜中的抗氧化有效成分［J］. 天然产物研究与开发, 1998, 10(2): 33.

　　［3］ Shin Ji-Eun.5-Hydroxy-7-(4"-hydroxy-3"-methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanone: a panereatic lipase inhibitor isolated from Alpinia officinarum［J］. Biol Parm Bull, 2004, 27(1): 138.

　　［4］ 周 漩, 郭晓玲, 冯毅凡, 等.不同产地高良姜挥发油化学成分的研究［J］. 中草药, 2006, 37(1): 33.

　　［5］ 李彩君, 黄劲梅, 谢培山, 等. HPLC法测定高良姜中高良姜素的含量［J］. 中药新药与临床药理, 2002, 13 (7) : 41.