重庆地区幽门螺杆菌对甲硝唑的耐药性和耐药机制的研究

                           作者：罗红春 吕琳 杨致邦 梅浙川

【摘要】  目的 了解重庆地区幽门螺杆菌(Heliobacter pylori，Hp)对甲硝唑的耐药情况，探讨Hp对甲硝唑耐药的分子机制，以助于指导临床用药。方法 分离培养获得96株Hp，采用琼脂稀释法进行体外抗生素敏感试验，检测Hp对甲硝唑的耐药率，比较主城区和周边区县的差异。挑选甲硝唑耐药Hp 44株，提取细菌DNA，PCR扩增rdxA基因。T?A克隆后测序，比较NCTC11637和44株临床分离株的基因序列。结果 重庆地区Hp对甲硝唑的耐药率为91.67%，主城区和周边区县耐药率无统计学差异(P>0.05)。与NCTC11637的基因序列比较，耐药Hp的rdxA基因出现插入突变和碱基替换突变。结论 重庆地区Hp对甲硝唑的耐药率较高，因此，甲硝唑不应再用于抗Hp。另外，部分甲硝唑耐药Hp存在rdxA基因突变，故rdxA基因突变可能是重庆地区甲硝唑耐药的重要原因。

【关键词】  幽门螺杆菌； 甲硝唑； 耐药性； 突变

    ABSTRACT  Objective  To investigate the prevalence and resistance mechanism of Helicobacter pylori(Hp) resistant to metronidazole in Chongqing area,and instruct clinical medication.  Methods  Ninety six Hp clinical isolates were cultured. The susceptibilities of the strains to metronidazole were tested by agar dilution test. Then compared the prevalence of Hp resistant to metronidazole in urban and in rural area. Of 44 Hp resistant strains to metronidazole were selected. The DNAs of Hp were extracted and prepared for PCR to amplify rdxA gene. The PCR amplification products were sequenced after T?A cloning. Then, the sequences were compared with NCTC11637.  Results  The prevalence of Hp resistant to metronidazole in Chongqing area was 91.67%. There was no statistically significant difference between the urban area and the rural area (P>0.05). In comparison with NCTC11637, mutations caused by base insertion and substitution in rdxA of the resistance isolates were found.  Conclusions  The results indicated that the prevalence of Hp resistant to metronidazole in Chongqing area was higher. In this aspect, metronidazole was used to treat Hp no longer. Additionally, the majority of metronidazole?resistant Hp strains in Chongqing have gene mutation in rdxA, it may be the key factor that causes metronidazole?resistant Hp in Chongqing.

    KEY WORDS  Heliobacter pylori;  Metronidazole;  Resistance;  Mutation

    幽门螺杆菌(Heliobacter pylori，Hp)是一种革兰阴性微需氧菌，自Marshall和Warren首先用微需氧技术分离出Hp之后，人们相继发现Hp与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病、皮肤病等有密切关系［1，2］。全球约一半的人口感染过Hp，通常在儿童时就已感染，若未使用抗生素干预，将会持续终生［1，3］。目前，治疗Hp常用三联和(或)四联方案： 两种抗生素加质子泵泵抑制剂(PPI)或(和)铋剂。甲硝唑是常用抗生素之一，但因甲硝唑的广泛应用，Hp对其耐药问题日益突出，并且耐药机制是否与氧不敏感的NADPH硝基还原酶(RdxA)有关，尚无定论。除此之外，Hp对甲硝唑的耐药率及耐药机制存在明显的地区差异，目前尚无关于重庆地区Hp对甲硝唑的耐药情况的报道，本试验对其进行了研究，以助于指导临床用药，并为全国Hp耐药率流行病学调查提供重庆地区的相关资料，现报道如下。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    96株Hp全部来自重庆医科大学附属第二胃镜室，其中主城区占54株，周边区县占42株。布氏肉汤(北京陆桥技术有限责任公司)；脱纤维灭菌羊血(杭州新锐生物工程有限公司)；琼脂粉(重庆百萃生物科技有限责任公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；PCR试剂盒(Fermentas公司)；琼脂糖(北京鼎国生物技术中心)；低温离心机(美国Kendro公司)；PCR仪(英国Barloworld Scientific公司)；凝胶成像仪(上海山富)；T?A克隆试剂盒及插入片段测序(重庆升博公司)。

    1.2  方法

    (1)Hp的培养和检测  用无菌活检钳夹取患者胃窦部黏膜两块，一块做快速尿素酶试验，一块置于Hp转送液中，选取快速尿素酶试验强阳性标本做Hp培养。将标本直接涂于加有抗生素添加剂的布氏肉汤血平板上，在5% O2、10% CO2、80% N2、5% H2的混合气体中，37℃培养3d。若培养基上长出无色透明，针尖大小，似露滴的菌落，可将其进行革兰染色镜检和快速尿素酶试验，全部符合标准者，确定为Hp。置脱纤维灭菌羊血中，-80℃保存。

    (2)药敏试验  按照美国临床实验标准化委员会(NCCLS)制定的琼脂稀释法进行药敏试验。将分离的冻存菌株在培养基上转种以保证其纯度与活力，用生理盐水制成菌悬液，在比浊仪上调整浊度到1.5×108CFU/ml，并计数为3×108CFU/ml，用于琼脂稀释法。将1ml不同稀释浓度的克拉霉素加入19ml布氏肉汤血培养基中，使其浓度范围在0.125～256mg/L用多点接种仪将菌液接种于培养基上。以无细菌生长的抗菌药物最高稀释度作为最低抑菌浓度(MIC)。拟定甲硝唑MIC>32mg/L为耐药菌株［4］，同时以标准菌株NCTC11637(重庆医科大学病原微生物教研室提供)做对照。耐药率的比较用χ2检验，P<0.05为有统计学差异。

    (3)Hp的DNA提取和PCR扩增  挑选典型甲硝唑耐药Hp44株，细菌基因组DNA提取试剂盒提取Hp DNA。PCR扩增引物上游：5′?GGGATTTTATT?GTATGCTACAA?3′，下游：5′?CAGGAGCATCAGATAGTTCT?3′扩增rdxA基因。反应体系50μl，包括模板2μl，2×PCR Master Mix 25μl，正反引物各1μl，双蒸水21μl。扩增反应条件：95℃预变性5min，95℃ 30s，46℃ 50s，72℃ 60s共32个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察片段大小。

    (4)T?A克隆和测序分析  将扩增的目的片段连入载体中，转化于E.coli DH 5α扩增。提取质粒，用核酸内切酶，BamHI和EcoRI切下克隆入载体的片段，委托重庆升博公司测定核苷酸序列。临床耐药株rdxA的核苷酸和氨基酸序列，与NCTC11637的rdxA基因序列比较。

    2  结果

    2.1  药敏结果

    重庆地区幽门螺杆菌的耐药情况见表1。结果显示重庆地区96株Hp对甲硝唑的耐药率较高，已达91.67%。主城区和周边区县耐药率的比较用χ2检验，P>0.05，无显著性差异。

    2.2  PCR扩增结果

    44株耐药Hp和NCTC11637的rdxA基因全部扩增出约830bp的片段(图1)，代表其中8株耐药Hp和NCTC11637的扩增片段。表1    重庆地区Hp对甲硝唑耐药情况

    2.3  Hp对甲硝唑的耐药性与rdxA基因突变关系分析

    与NCTC11637菌株rdxA基因序列比较，44株甲硝唑耐药Hp均因核苷酸中碱基突变和(或)缺失，引起所编码的氨基酸改变(表2)。

    3  讨论

    甲硝唑属硝基咪唑类药物，因其杀菌活性不受胃内低pH的影响，在胃腔内浓度高，具有较强的抗Hp活性，而且价格便宜，成为抗Hp常用药物之一。但随着甲硝唑的广泛应用，对甲硝唑耐药的Hp菌株在短时间内大量出现。Hp对甲硝唑的耐药是全球性的，不同国家和地区的耐药率也存在明显差异，一般来说，发达国家耐药率相对较低，波动于10%～50%之间，如西班牙13.8%［5］，瑞士27%［6］，芬兰38%［7］；发展家耐药率相对较高，波动于60%～90%之间，如印度东部为85%［8］，中国云南为67.89%［9］。在同一国家不同地区，Hp对甲硝唑的耐药率也存在着明显的差异，如北京、西安、广东、沈阳和武汉等地耐药率的报道分别为37%、58%、51.8%、40%和67%。本研究结果显示在重庆地区幽门螺杆菌对甲硝唑耐药率已达91.67%，远远高出以上各地所报道的耐药率。这可能与甲硝唑已广泛用于妇科、口腔科、外科手术中的抗厌氧菌治疗及传染病中抗阿米巴治疗有关。所以甲硝唑在重庆地区应不再用于抗Hp治疗，可以用另一种硝基咪唑类药物替硝唑替代。已有实验证明Hp对替硝唑的耐药率仅4.17%，故可作为抗Hp的一线药物。 表2 甲硝唑耐药Hp的rdxA基因突变分析nt：核苷酸。

    Hp对甲硝唑耐药的机制可能是：①rdxA基因的突变［10］；②frxA、frxB基因的突变［11，12］；③DNA修复增加［13］；④甲硝唑摄入减少而外排增多；⑤过氧化氢酶和过氧化物歧化酶活性增加，其中较多学者认为rdxA基因突变对甲硝唑耐药性影响最大。rdxA基因的突变可使硝基还原酶失活，使进入菌体的甲硝唑不能生成具有细胞毒性的代谢产物，以致无法杀灭细菌导致耐药。不少研究资料证实甲硝唑耐药Hp菌株的rdxA基因突变大多为随机性的，未能肯定某一位点突变与耐药直接相关［14］。

    本研究通过对NCTC11637和44株耐药Hp测序，分析突变株与耐药的关系，发现rdxA突变的类型包括插入突变和碱基替换。碱基插入突变可导致氨基酸替代和终止密码的出现，形成截短的肽链。如表2所示，8株耐药Hp在216核苷酸处插入了3个碱基T，翻译成苯丙氨酸，即在72位氨基酸后插入了一个苯丙氨酸，而未发生移码突变及遇终止密码。这种插入突变在中尚未报道。但是插入突变是否与这8株Hp对甲硝唑耐药有关，尚不能确定，因为这8株Hp还存在其它碱基替换突变。有2株耐药Hp在179nt后插入碱基A，出现氨基酸替换，随后遇终止密码。由于这2株耐药Hp无其它碱基替换突变，所以我们认为在179nt后插入碱基A是导致其耐药的主要原因。碱基替换突变同样可以导致氨基酸替代和终止密码的出现，例如，有5株耐药Hp发生328A→T突变，形成终止密码UAA；有6株耐药Hp发生148C→T突变，形成终止密码UAG。研究结果显示，这6株耐药Hp仅发生148C→T突变，之后形成终止密码。故我们认为，148C→T突变可能是导致其耐药的主要原因。

    由于存在基因多态性，Hp对甲硝唑的耐药机制是否与rdxA基因突变有关，尚无定论。国外文献也报道一些无rdxA基因突变的菌株对甲硝唑耐药［15］。这种现象提示，rdxA基因失活与耐药表型并不总相关，可能还有其它机制。目前由于仅少数甲硝唑耐药菌株被研究，所以在接受rdxA基因突变是Hp对甲硝唑最重要的耐药机制前，还需要研究更多不同国家，不同地区甲硝唑耐药Hp的rdxA基因突变情况，以阐明其耐药机制。

    综上所述，重庆地区患者感染的Hp对甲硝唑的耐药率较高，部分耐药Hp存在rdxA基因突变。因此，就重庆地区而言，甲硝唑应不再用于抗Hp，可用替硝唑替代，并且，Hp中rdxA基因突变可能是导致该区Hp对甲硝唑耐药的主要因素。

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