HPLC?CDD法测定盐酸头孢吡肟及其制剂中的N?甲基吡咯烷的含量
作者：闵翠娥 谭胜连 陆媛 张旭途
【摘要】 目的 建立高效液相?电导法(HPLC?CDD法)测定盐酸头孢吡肟中N?甲基吡咯烷含量的方法。方法 以羧酸基键合硅胶为分析柱的填充剂metrosep C2(100mm×4.0mm，7μm)；流动相为0.01mol/L硝酸溶液∶乙腈(99∶1)；流速1ml/min；柱温35℃；进样量20μl；检测器：电导检测器。结果 N?甲基吡咯烷在4.8～38.8μg/ml浓度范围与峰面积呈良好的线性关系，r=0.9999。高、中、低三种浓度的平均回收率为101.2%，RSD为1.3%。结论 该方法简便、准确、灵敏度高，重现性好，可作为盐酸头孢吡肟中的N?甲基吡咯烷的含量测定方法。
【关键词】 HPLC?CDD； N?甲基吡咯烷； 注射用盐酸头孢吡肟
ABSTRACT Objective To develop an HPLC method for the determination N?methylpyrrolidine in cefepime dihydrochloride. Method The chromatographic condition: the column was a silica gel with caboxyl groups particle (metrosep C2 100mm×4.0mm, 7μm). The mobile phase consisted of acetonitrile∶0.01 mol/L nitric acid (1∶99), an electric conductivity detector was used, the flow rate was 1.0ml/min, the column temperature was 35℃. Results The calibration curve was linear (r=0.9999) in the range of 4.8～38.8 μg/ml for N?methylpyrrolidine, the average recovery was 101.2% (n=9), and the average RSD was 1.3%. Conculsion The method is accurate, simple, rapid, and with good reproducibility for quality content of N?methylpyrrolidine in cefepime hydrochloride.
KEY WORDS HPLC?CDD; N?methylpyrrolidine; Cefepime hydrochloride
头孢吡肟(cefepime)是第四代头孢菌素，具有独特的抗菌作用。盐酸头孢吡肟及其制剂中N?甲基吡咯烷的测定一直是检验的难题。美、日药典收载HPLC?CDD法［1，2］，国内有气相色谱法［3］和毛细管电泳法［4］。本文对［1，2］的方法进行优化，将分析柱由“键合磺酸基的硅胶柱”改成“键合羧酸基的硅胶柱”，N?甲基吡咯烷测定的色谱峰的质量好、重复性好，测定方法更为准确、方便、可靠。该方法未见文献报道。
1 仪器和试药
仪器 日本岛津LC?10A高效液相色谱仪，包括LC?10AT泵， SPD?10A紫外可见检测器， CTO?10A柱温相，HW?2000工作站，上海超声仪器厂CQ?250超声波清洗器。
试药 N?甲基吡咯烷对照品(美国Aldrich公司，批号S31588?1，97%)，注射用盐酸头孢吡肟(批号060930，061034，061130)由本公司提供。乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适应性
色谱柱：Metrosep C2(100mm×4.0mm，7μm)；流动相为0.01mol/L硝酸溶液∶乙腈(99∶1)；流速1ml/min；柱温35℃；进样量20μl。取对照品溶液数次进样，其相对标准差(RSD)不得超过5.0%。
2.2 溶液配制
供试品溶液的制备 精密称取本品适量，加0.01mol/L硝酸溶液制成每1ml含相当于头孢吡肟约5mg的溶液，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备 精密称取N?甲基吡咯烷对照品，加水制成每1ml中含0.5mg的溶液，精密量取此溶液5ml，加0.01mol/L硝酸溶液稀释成100ml，摇匀，作为对照品溶液。
2.3 空白溶剂、L?精氨酸干扰性试验
精密称取L?精氨酸适量，加0.01mol/L硝酸溶液制成10mg/ml的溶液，按上述色谱条件进样，取空白溶剂和L?精氨酸适量进样，记录色谱图，结果表明L?精氨酸不干扰N?甲基吡咯烷的测定(图1)。
2.4 与钠、钾、氨、三乙胺分离度试验
分别称取钠、钾、氨、三乙胺适量，分别加0.01mol/L硝酸溶液制成5、10、5和70μg/ml的溶液，再分别取上述溶液适量置同一容量瓶中，混匀。分别取上述钠、钾、氨、三乙胺溶液及其混合溶液，按上述色谱条件进样，记录色谱图，结果表明钠、钾、氨、三乙胺分离度符合规定，不干扰N?甲基吡咯烷的测定。
2.5 精密度试验
取对照品溶液20μl，连续进样5次，RSD为0.58%。
2.6 线性关系
精密称取N?甲基吡咯烷对照品约50mg置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取此溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和8.0ml，分别置100ml量瓶中，加0.01mol/L硝酸溶解至刻度，摇匀，照N?甲基吡咯烷含量测定方法测定，记录色谱图，以N?甲基吡咯烷峰面积A为纵坐标，以N?甲基吡咯烷的浓度C(mg/ml)为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程为：
A=12.7992+3777C r=0.9999
结果表明N?甲基吡咯烷在4.7～37.7μg/ml浓度范围内与其峰面积有良好的线性关系。
2.7 最小定量限
在上述色谱条件下，按信噪比为10∶3，测得N?甲基吡咯烷的最小定量限为0.486μg/ml。
2.8 加样回收实验
精密称取注射用盐酸头孢吡肟(批号060930)约100mg，共9份，分三组，分别加入0.5mg/ml对照品溶液0.4ml、0.5ml、0.6ml，用0.01mol/L硝酸溶液稀释至10ml，摇匀。按N?甲基吡咯烷含量测定方法测定，记录色谱图，照含量测定项下的方法，回收率101.2%，RSD为1.3%(表1)。
2.9 含量测定
取供试溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取上述N?甲基吡咯烷对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算出供试品中N?甲基吡咯烷的含量。并将本方法与［2］方法进行对比，结果见表2。
3 讨论
(1)N?甲基吡咯烷无紫外吸收，不能使用紫外检测器检测。利用N?甲基吡咯烷中的N+可选择电导检测器进行测定。
(2)N?甲基吡咯烷既是合成的原料又是头孢吡肟的降解产物，且盐酸头孢吡肟为酸性物质，N?甲基吡咯烷为碱性物质，两者共存时部分N?甲基吡咯烷被中和成盐，成盐的N?甲基吡咯烷无法直接气化［3］等特性，使采用气相色谱法测定盐酸头孢吡肟中N?甲基吡咯烷变得复杂。若采用直接进样，气化时的高温使盐酸头孢吡肟降解，而成盐的N?甲基吡咯烷不能气化，影响测定结果；若采用有机溶剂萃取，一方面样品不溶解会包裹N?甲基吡咯烷，另一方面盐酸头孢吡肟是酸性，在酸性条件下成盐的N?甲基吡咯烷萃取不完全，因此，有机溶剂萃取法也不能准确测定盐酸头孢吡肟中N?甲基吡咯烷的含量。目前采用气相色谱法并不能准确测得盐酸头孢吡肟中微量N?甲基吡咯烷杂质的含量。
(3)美、日药典方法系统难平衡，测定时间长(检测一个样品约2～3h)，保留时间重复性差，基线漂移明显，柱寿命短［4，5］。我们将该方法中的分析柱由“键合磺酸基的硅胶柱”改成“键合羧酸基的硅胶柱”，优化后的方法，样品测定时间短(检测一个样品约30min)，保留时间重复性好，基线平稳，柱耐用，N?甲基吡咯烷的色谱峰的质量好、重复性好，测定方法更为准确、方便、可靠。
(4)溶液的稳定性在实验过程中，盐酸头孢吡肟中N?甲基吡咯烷的量随放置时间延长而略有增加。因此，本品配置后宜立即进样或20min内测定。
【文献】
［1］ United states pharmacopeial convention. Cefepime for injection ［S］. (USP 26). Rockville: United states pharmacopeial convention Inc. 2003:360.
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