脱镁叶绿酸的制备及其光敏抗菌活性

                         作者：唐蕾 徐磊 韩跃 毛洪 

【摘要】  以初步纯化的叶绿素为原料，利用叶绿素酶水解、选择性酸降解两种方法制备脱镁叶绿酸。高效液相色谱分析显示两种方法得到的产物图谱相似，酸降解产物中脱镁叶绿酸A的含量较高。抗菌实验表明脱镁叶绿酸对革兰阳性菌具有光敏抑菌效果，对革兰阴性菌和酵母无明显作用。

【关键词】  脱镁叶绿酸； 叶绿素酶； 高效液相色谱； 光敏抗菌活性

    ABSTRACT  Partially purified chlorophyll was used to prepare pheophorbide (Pheide) by chlorophyllase hydrolysis and selective acidic hydrolysis methods. High performance liquid chromatography analysis showed that the Pheide A was obtained with higher purity by acidic hydrolysis method. The antimicrobial test showed that Pheide had obvious photosensitive activity against Gram positive bacteria.

    KEY WORDS  Pheophorbide;  Chlorophyllase;  High performance liquid chromatography;  Photosensitive antimicrobial activity

   光敏剂是一些具有光活性的化合物，可以选择性地富集在特定的组织，在紫外或可见光的激发下，产生光动力杀伤作用，起到杀菌和肿瘤的功效。近年来，由于抗生素的滥用所引起的毒副作用、耐药菌的出现和微生物群落的破坏，使得天然、环境友好、能够有效地杀灭有害菌而不伤及邻近组织的光敏剂颇受关注［1］。脱镁叶绿酸(Pheide)作为卟啉类光敏活性剂具有结构明确、稳定，在红外区有较强的吸收，光敏活性更有效等特点，在癌症的光敏动力学治疗中已有报道［2～4］，但其光敏杀菌作用尚待探讨。此外，脱镁叶绿酸作为叶绿素(Chl)的中间降解产物在植物中很少积累，分离困难，但可以通过叶绿素的酶促水解和酸降解法获得［5，6］。基于上述分析，本文对酶法和酸法叶绿素降解产物进行了比较，并研究了其对细菌和酵母的光敏活性。

    1  材料与方法

    1.1  菌种    酵母  八孢裂殖酵母(Schizosaccaromyces octos?porus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黏红酵母(Rhodotorula glutins)、隐球酵母(Cryptococcus sp.)。

    细菌  产气肠杆菌(Aerobacter aerogenes)、金葡菌(Staphylococcus aureus)、四联球菌(Micrococcus tetraglnus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinese)、白葡萄球菌(Staphylococcus albus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)。均为实验室保藏菌种。

    1.2  培养基及培养条件

    酵母培养基  酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，定容至1000ml，pH6.0。

    细菌培养基  NaCl 5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，定容至1000ml，pH7.0。121℃灭菌20min。

    培养温度  酵母28℃，细菌37℃，光照为培养箱内置光源。

    1.3  抗菌实验

    (1)在固体平板上均匀涂布200μl菌液，取10μl待测样品溶液于直径6mm的滤纸片上，稍干后贴于已接菌的琼脂培养基表面，光照条件下恒温培养24h，观察、记录抑菌圈大小，并与阳性对照药物(细菌为氨苄西林，酵母为放线菌酮)相比较，每个处理设3个重复。

    (2)将待测菌在含有50μg/ml的Pheide培养基上十字划线，比较光、暗条件对微生物生长的影响，每个处理设3个重复。

    1.4  叶绿素的提取

    参照Iriyama法［7］，从菠菜中提取和纯化叶绿素，丙酮溶解，测定溶液在645和663nm处的吸光值，按照Arnon公式叶绿素含量：

    Chl A(mg/ml)=0.0127A663-0.00269A645

    Chl B(mg/ml)=0.0229A645-0.00468A663

    1.5  脱镁叶绿酸的制备

    (1)酶解法  采集新鲜的豌豆叶，洗净晾干，在冷丙酮中匀浆后过滤，滤物用冷丙酮漂洗并干燥。1g过滤物用25mL磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0，内含0.24% TritonX?100)搅拌抽提4.5h，在8000r/min，4℃条件下离心10min，上清液即为所需叶绿素酶酶液。叶绿素酶酶液中蛋白含量的测定采用双缩脲法。叶绿素酶溶液、20mmol/L磷酸缓冲液和0.15mg/ml叶绿素充分混匀(该反应体系中蛋白质终浓度为3.2μg/μl、丙酮40%、TritonX?100 0.60%，pH7.0)，在37℃恒温水浴中12h反应完全后，加入正己烷∶丙酮∶10mmol/L KOH(3∶2∶1)涡漩混匀，在8000r/min，4℃的条件下离心10min。取下层并加入几滴盐酸酸化即得到脱镁叶绿酸溶液，4℃冰箱避光保存。

    (2)酸解法  采用Hynninen选择性酸法水解［6］，盐酸?乙醚分级分离，将醚层中的溶剂挥发，得到的脱镁叶绿酸溶于丙酮中，4℃冰箱避光保存。

    1.6  高效液相色谱条件

    色谱柱为Eclipse×DB?C18(150mm×3.0mm，5μm)；流动相为95%甲醇溶液(色谱纯)；流速0.8ml/min；检测波长430nm。

    2  结果与讨论

    2.1  脱镁叶绿酸的制备

    脱镁叶绿酸作为天然卟啉是叶绿素降解的中间产物，在茶叶、柑橘、老化叶中普遍存在，但含量低，分离困难。一般通过叶绿素酶催化，植醇基水解，得到脱植醇叶绿素，继而酸化得到脱镁脱植醇叶绿酸即Pheide(图1)。

    由于疏水性植醇基的去除，Pheide的亲水性大大增加，可以通过液液分离将底物Chl与产物Pheide分离。由于Chl A和Chl B同时可以作为叶绿素酶的底物，因而产物中除Pheide A外还常含有少量的Pheide B。Hynninen等［6］根据Chl A、B植醇基水解能力的不同，开发了直接从Chl A、B混合物通过选择性酸降解制备Pheide A的方法。图2为菠菜色素的粗提液，经过Iriyama法纯化得到Chl A、B，和选择性酸降解产物的薄层层析结果。得到的产物条带经质谱分析显示分子量为592与Pheide A一致。高效液相色谱是检测叶绿素、类胡萝卜素、叶黄素等色素的常用分析手段，本研究用反相高效液相色谱，选择叶绿素和类胡萝卜素的检测波长430nm比较两种制备方法，图谱显示两者的结果相似，其中选择性酸降解的纯度较高(图3)。

    2.2  脱镁叶绿酸抗菌实验

    我们首先选择实验室保存的5种细菌和6种酵母进行了光敏抑菌实验，结果表明脱镁叶绿酸对革兰阳性菌有明显的抑菌作用，但对革兰阴性菌和酵母没有抑制作用(表1)。为了进一步验证该结果，以多种细菌(产气肠杆菌、金葡菌、四联球菌、北京棒杆菌、枯草芽孢杆菌、白葡萄球菌、大肠埃希菌)为对象，比较了光照和黑暗培养条件下细菌的生长情况，发现光照显著抑制了革兰阳性菌的生长(图略)。该结果与其它卟啉类化合物所得的结果一致［8～10］。制备方法(酸法和酶法降解)对所得的结果没有显著影响。

    3  结论

    天然光敏抗菌剂在解决抗生素的毒副作用和抗生素耐药性、选择性杀灭有害菌和保护微生物群落方面具有优势。叶绿素来源广泛，其卟啉降解产物在植物中普遍存在，安全、可靠，是天然光敏剂的良好候选者。本文的研究表明，采用酶法和酸法均可得到以脱镁叶绿酸为主的产物，该产物对包括金葡菌在内的革兰阳性病原微生物具有光敏抑菌作用，对酿酒酵母等酵母无抑制作用。

【】
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［7］ Iriyama K, Ogura N, Takamiya A. A simple method for extraction and partial purification of chlorophyll from plant material using dioxane ［J］. J Biochem,1974,76(4):901～904.

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