克拉维酸发酵过程变温控制的研究
作者：朱校适 冯涛 王永红， 黎亮 张嗣良 刘新山 曹斌
【摘要】 本文在50L自动控制发酵罐上进行了克拉维酸发酵过程温度控制优化试验。分别将发酵过程全程温度控制在24℃、26℃、28℃下进行发酵时，通过对发酵各阶段的重要参数的对比分析，发现温度对棒状链霉菌的生长和代谢有重要影响，降低对数生长期发酵温度可明显缓解前期供氧不足的矛盾。进而通过对发酵过程的变温控制，使克拉维酸的产量由原来3950mg/L提高到4500mg/L，增产11.5%。
【关键词】 克拉维酸； 发酵； 变温控制； 溶氧
ABSTRACT The present work reported optimization of temperature?control strategy in the process of clavulanic acid fermentation on 50L?fermentor. Fermentations run under isothermal way in full processes at 24℃, 26℃ and 28℃ respectively. The profound parameters involved in metabolism were compared and analyzed by different phases. It was found that the temperature greatly affected the growth and metabolism of Streptomyces clavuligerus; lower temperature evidently increased the dissolved oxygen level at the idiophase. Finally a new temperature?control strategy was adopted and clavulanic acid production increased by 11.5%.
KEY WORDS Clavulanic acid; Fermentation; Temperature?control; DO
克拉维酸(clavulanic acid，CA)是一种β?内酰胺酶抑制剂，本身抗菌活性很弱。但当CA与β?内酰胺类抗生素制成复方后可以增强β?内酰胺类抗生素的抗菌活性和增大其抗菌谱，有助于克服β?内酰胺类抗生素耐药性。
CA是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种次级代谢产物。在研究中我们发现CA发酵在进入对数生长期后溶氧易于跌零，影响CA生物合成。据报道温度对棒状链霉菌生长和CA合成都有影响［1～3］。本文以生产菌种为对象，考察温度对CA发酵的影响并研究如何通过变温控制提高CA的发酵水平。
1 材料与方法
1.1 菌种
棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus) F2?1，由山西威奇达制药厂提供。
1.2 试剂
硫酸氢四丁基胺、 NaH2PO4·2H2O、 乙腈(色谱级)、NaOH、CA标准品。
1.3 培养基 (1)种子培养基主要成分为甘油、豆粉、糊精；pH8.0，121℃灭菌30min。
(2)发酵培养基主要成分为甘油、豆粉、糊精、吗丙酸、FeCl3、ZnCl2、MgSO4、MnSO4、CuSO4、CaCl2、FeSO4，pH7.0，121℃灭菌25min。
1.4 培养
(1)种子培养 在无菌的条件下，向装量为600ml/3000ml三角瓶中接入3.5ml孢子液。在25℃，230r/min条件下摇床培养72h，然后转入二级种子罐培养48h。
(2)发酵培养 在无菌条件下，从种子罐取1L种子液接入装量为35L发酵液的50L罐中进行培养。采取分批补料工艺，从20h左右开始补加甘油，用20%氨水自动调控pH在7.0±0.05范围之内。以溶氧30%作为最低限制性溶氧值，每间隔8h取样进行离线参数测量，包括pH、菌浓、黏度等参数并涂片观察菌丝状态；从31h开始进行效价测量。发酵最后阶段每4h取样一次。当大比例的菌丝开始自溶、溶氧回升、效价停滞时放罐。
1.5 测定方法
(1)菌体浓度的测定 采用菌丝占溶液体积的百分比表示。取10ml发酵液反复的离心(3500r/min，10min)和洗涤，直到离心后的固含物中不含有杂质为止，记下菌丝的体积百分比作为菌体浓度；发酵液第一次离心得到的上清液留用。
(2)尾气分析 采用生物尾气分析仪(PS6000型，购自重庆哈特曼测量仪器有限公司)对二氧化碳释放速率(CER)和摄氧率(OUR)，呼吸商(RQ)进行数据采集。
(3)克拉维酸测定 采用高效液相色谱法。色谱柱SB?C18(4.6mm×100mm，3.5μm)，流速1.5ml/min，温度33℃，注射量20μl；检测波长210nm，压力60～100bar。流动相为10mmol/L硫酸氢四丁基胺∶甲醇(100∶15，V/V)，pH2，硫酸氢四丁基胺需要用0.45μm有机膜过滤。
样品处理 精确称取发酵液离心所得的上清液0.5±0.05g，置100ml的容量瓶中，用pH5.4含乙腈6%的20mmol/L的NaH2PO4溶液定容。用2μl的微量进样器进样。
2 结果与分析
2.1 恒温培养对CA发酵水平的影响
培养温度不仅影响各种蛋白质的合成及其合成速率，也影响各种生物酶的活性和菌体的生长、代谢以及次级代谢物的合成。本研究首先选择在三种温度下对CA发酵进行恒温培养，各批次从发酵开始到溶氧低于30%前，其空气流量和搅拌转速均相同。恒温培养结果如Tab.1所示。
由Tab.1可见，在26℃恒温发酵条件下CA的最终效价最高，这与大部分文献中采取的最适发酵温度28℃［4～6］不同，发酵周期随温度的提高明显缩短。发酵过程中菌浓和CA的增长情况见Fig.1(数据为各培养温度下五个批次的均值)。
Fig.1显示，虽然整个发酵周期随培养温度升高而缩短，但CA合成周期长度相差不大。CA合成曲线的斜率都存在一个明显转折点，转折点之前斜率较大，之后斜率突然变小(即在CA合成的前期合成速率较大，后期合成速率明显变小)。图中竖线A对应28℃条件下菌浓达到最大值时的时间(tA)，竖线B对应24℃、26℃条件下菌浓达到最大值的时间(tB)；tA和tB分别是各CA合成曲线的转折点对应的时间，所以CA的生产和菌体的生长存在着一定相关性。可通过对菌体生长的控制来延长菌丝生长的时间，以提高CA生物合成。
恒温发酵过程前期DO、CER、OUR和RQ随时间的变化如Fig.2所示。各温度下，开始阶段CER、OUR和DO的变化均非常小，但RQ值变化较明显，表明菌浓变化较小而菌体的代谢能力在增强。随着CER、OUR的显著增大，DO迅速变小，RQ缓慢增大，表明菌浓在增大、菌体活力仍在增强，即菌体进入了对数生长期。纵向比较，随着温度的降低延滞期越来越长，24℃时其延滞期比28℃条件下长了近8h，发酵周期也有所延长，所以前期不宜采取较低的培养温度。
稳定期是菌丝处于生长速率和死亡速率相等的动态平衡阶段，细胞的呼吸和代谢强度较发酵中期减弱。在此阶段细胞合成CA的能力逐渐减弱，而CA降解的影响愈加突出，什么温度更有利于CA的合成和积累是问题的关键。
由Fig.3可见，随着培养温度的升高，CER和OUR水平明显提高、产量增加。这表明菌丝的代谢强度随着温度的升高而增强，CA的合成能力也有提升。所以在发酵的后期应采取较高的培养温度。
2.2 变温控制工艺
根据以上的实验结果制定温度控制方案。发酵前期温度控制在26℃或28℃以缩短延滞期；在对数期，待菌浓增长到一定浓度后，降低温度以便放缓菌丝的生长速度、延长菌丝的生长时间；最后阶段恢复到26或28℃。变温发酵过程控制参数见Fig.4。
是采用变温控制工艺的两个批次的发酵过程。虽然前、后期控制的温度不同，但最终效价相差不大。经过多批的实验验证，对数生长期降温控制策略减缓了细胞的生长速率，延长了菌丝生长的时间，同时解决了对数生长期供氧紧张的问题。最终效价平均值在4300mg/L以上，最高达4500mg/L。
3 结论
在CA发酵过程中可以通过变温控制的方式对菌体的生长和生产进行控制。在发酵前期选用较高的温度，可缩短菌丝的延滞期；在发酵的中期用温度控制菌体比生长速率的方式可以提高菌丝的合成CA能力并同时延长了菌丝高速生产的时间。另外，降低对数生长期发酵温度明显缓解了前期供氧不足的矛盾。在发酵的最后阶段采用较高的培养温度有利于CA的积累。
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