微生物来源的次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶抑制剂2264 A和B的研究

         作者：林洁 可爱兵 张雪莲 郑智慧 朱京童 路新华* 李业英 崔晓兰 石英 张华 贺建功

【摘要】  利用自建的快速高效的次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶(Inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH)抑制剂的高通量筛选模型，筛选分离得到两个活性化合物2264 A和B，通过对其紫外、质谱、核磁等理化数据的分析确定2264 A为cyclopenol，2264 B为viridicatol。2264 A和B对IMPDH的IC50分别为69.68、11.86μmol/L；体外脾淋巴细胞增殖实验显示2264 A和B分别在322.6和65.8μmol/L浓度下可完全抑制由ConA活化的脾淋巴细胞增殖，表明2264 B在分子水平和细胞水平均表现出较好的免疫抑制活性，2264 A的活性相对较弱。

【关键词】  次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶； 免疫抑制剂； Cyclopenol； Viridicatol

    ABSTRACT  Inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) is an essential rate?limiting enzyme in the purine metabolic pathway, catalyzing the de novo synthesis of purine nucleotides required for lymphocyte proliferation. IMPDH has therefore been an attractive target for developing immunosuppressive drugs. This investigation was to discover new IMPDH inhibitors from metabolites of microorganism, and two active compounds 2264 A and B were isolated. 2264 A and B were identified to be cyclopenol and viridicatol by their physicochemical properties, MS, 13C?NMR and 1H?NMR analysis. IC50 of 2264 A and B were 69.68 μmol/L and 11.86 μmol/L to IMPDH, respectively, and they could completely inhibit the spleen lymphocytes proliferation stimulated by ConA at 322.6 μmol/L and 65.8 μmol/L in vitro. 2264 A and B showed moderate inhibitory activity to IMPDH and spleen lymphocytes proliferation.

    KEY WORDS  Inosine monophosphate dehydrogenase;  Immunosuppressant;  Cyclopenol;  Viridicatol

     免疫抑制剂在临床上应用广泛，不仅能够有力地推进临床器官移植的实施，延长移植物的存活率，改善器官移植患者的生存质量，同时也为许多自身免疫性疾病如红斑狼疮、类风湿病等的开辟了广阔的应用前景。但是现有的免疫抑制剂在临床应用中仍然存在不同程度的毒副作用、治疗对象和方案较局限等缺点，普遍存在一些严重不良反应，如肝毒、肾毒、神经毒性、消化道反应、内分泌系统失调、皮肤损坏和致癌作用等。因此开发全新的低毒、高效免疫抑制剂很有必要［1，2］。

    次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶(inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH)是鸟嘌呤核苷酸经典合成途径的限速酶，IMPDH受抑制将导致鸟嘌呤核苷酸缺乏，DNA合成受阻，使细胞静止于G1期，因此其活性与细胞增殖紧密联系。这种酶的抑制剂被发现具有抑制免疫力的作用［3，4］，因此IMPDH成为免疫相关疾病药物的重要靶点。

    为了研究和发现更加有效和低毒的免疫抑制药物先导化合物，本研究利用以IMPDH为靶点的高通量筛选模型从微生物的代谢产物中进行药物筛选，并从阳性菌株2264的发酵产物中分离得到活性化合物2264 A和B。本文报道了2264 A和B的筛选、发酵、分离纯化、结构鉴定及其生物学免疫活性。

    1  材料与方法

    1.1  筛选用微生物的菌株

    真菌菌株2264由本室从5000株真菌中筛选得到。

    1.2  试剂及仪器

    人类II型IMPDH表达质粒由本实验室构建；E.coli DH5α由本实验室保存；NADH、NAD和IMP(Sigma公司)；BABL/C小鼠，雌性，6周龄(河北医科大学实验动物厂)；RPMI?1640(GIBCO公司)；十二烷基硫酸钠(Lauryl Sulfate Sodium，SDS)(GIBCO公司)；新生牛血清(杭州四季青)；噻唑蓝(Thiazolyl Blue，MTT)(Sigma公司)；青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)；其余化学试剂均为分析纯或色谱纯试剂。

    Victor2 1420多标计数仪(美国PE)；中压层析系统(瑞士BUCHI)；高压液相(美国Waters)；ZMD Micromass质谱仪(ESI?MS，美国Waters)；INOVA?500MHz核磁共振仪(Varian)；96孔培养板(美国Corning)。

    1.3  IMPDH抑制剂活性测定原理及方法

    活性测定原理  以NAD和IMP为底物，NADH为显色剂，在96孔板上测定样品对IMPDH抑制剂活性。反应式为：

    活性测定方法  在96孔板上，样品孔中加入2μl待测样品、20μl酶提取液和30μl IMP；对照孔中加入2μl DMSO，30μl IMP；空白孔中加入2μl DMSO和20μl IMPDH缓冲液代替酶提取液和30μl IMP。37℃保温15min，测定孔A340(OD1)，然后每孔中加入50μl NAD，37℃保温50min，测定每孔A340(OD2)。样品对IMPDH抑制率的公式为：

    抑制率(%)=对照(OD2-OD1)-样品(OD2-OD1)对照(OD2-OD1)-空白(OD2-OD1)×100%

    1.4  对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用［5］

    按常规方法制备脾淋巴细胞悬液，用含10%新生牛血清的RPIM?1640培养液重悬，调整细胞浓度至1×107个/ml，加入96孔细胞培养板100μl/well，同时实验组加入待测样品和ConA。阴性对照用相应培养液代之，ConA对照组终浓度为2μmol/L，阳性对照为霉酚酸(MPA)，平行设3个复孔。置5% CO2，37℃培养箱培养72h，每孔加入MTT液(5mg/ml)20μl，继续孵育5h后，每孔加入10% SDS液100μl溶解，37℃湿盒过夜，待结晶完全溶解，用Victor2 1420多标记数仪检测各孔光吸收(OD)值，检测波长570nm，波长630nm，并计算脾淋巴细胞增殖抑制率。

    细胞生长抑制率(%)=对照组OD值-实验组OD值对照组OD值×100%

    1.5  2264的培养

    将真菌2264斜面菌株，接种于种子培养基(淀粉2%，葡萄糖1%，黄豆饼粉0.2%，麦芽粉0.6%，酵母粉0.5%，CaCO3 0.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，NaCl 0.2%，pH7.0)于27℃、72h摇瓶培养，接种于装量为100g大米培养基的500ml三角瓶中(大米浸泡3d，加入2.5%的热榨黄豆饼粉，搅拌均匀，120℃消毒30min)，27℃静置培养14d。

    1.6  2264 A和B的分离纯化

    2264固体培养物约3kg，每100g大米用200ml乙酸乙酯浸泡1h，过滤除去大米，经无水Na2SO4脱水，浓缩抽干得到粗提物。

    将粗提物用少量甲醇溶解，分别经硅胶柱(φ2.6cm×20cm，氯仿?甲醇)、Sephedax LH20(甲醇)层析分离，得到活性组分1和2。

    将活性组分1和2分别使用ODS反相柱(Phenomenex，21.2mm×250mm)在制备型HPLC上进行单组分的制备。以乙腈∶0.1%磷酸溶液(35∶65)为流动相，流速16ml/min，检测波长210nm，最终得到活性化合物2264 A和B。

    2  实验结果

    2.1  2264 A和B的理化性质及结构

    2264 A为淡黄色粉状物，溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯和氯仿。UVλmax(MeOH)为201和285nm；ESI?MS测定结果显示该化合物的分子量为310；1H?NMR及13C?NMR数据见表1，结合［6～9］确定该化合物为cyclopenol，分子式C17H14N2O4；2264 A化学结构见图1。

    2264 B为无色晶状物，溶于甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯。UVλmax(MeOH)为221、284和318nm；ESI?MS测定结果显示该化合物的分子量为253；1H?NMR及13C?NMR数据见表2，结合文献［8～10］确定该化合物为iridicatol，分子式C15H11NO3； 2264B化学结构见    表1    2264 A的核磁数据归属表(CD3COCD3)表2    2264 B的核磁数据归属表

    2.2  2264 A和B对IMPDH的抑制活性

    分别取浓度梯度稀释的2264 A和B对IMPDH进行活性测定，结果见图2、图3；其IC50分别为69.68、11.86μmol/L。

    2.3  2264 A和、B对脾淋巴细胞增殖的抑制作用

    为了进一步验证化合物2264 A和B在细胞水平对淋巴细胞增殖的抑制作用，本研究对两个化合物进行了脾淋巴细胞体外增殖抑制实验。结果表明2264 A、B分别在322.6和65.8μmol/L浓度下可完全抑制由ConA活化的脾淋巴细胞增殖，说明2264 B在细胞水平表现出较好的免疫抑制活性，而2264 A的活性相对较弱。

    图2    2264 A和B对IMPDH的抑制

    3  讨论

    IMPDH是鸟嘌呤核苷酸经典合成途径的限速酶，可抑制鸟嘌呤核苷酸的起始合成途径，使鸟嘌呤核苷酸耗竭，阻断DNA的合成，抑制活化的T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，降低机体免疫反应，因此IMPDH已经成为研制开发免疫相关疾病药物的重要靶点。国外一些大公司已竞相开展IMPDH抑制剂类药物的研究，其中如霉酚酸是高效、选择性、非竞争性、可逆性IMPDH抑制剂，具有较好的免疫抑制和抗癌活性。其前体霉酚酸酯已于1998年10月在美国批准上市，主要用于肾脏、心脏移植后的器官排斥的预防。在美国上市的同时也在我国注册上市。本品还用于狼疮性肾炎、原发性肾病综合征以及类风湿性关节炎的治疗［11，12］。

    为了从微生物代谢产物中发现新的IMPDH抑制剂，本研究利用自建的体外IMPDH抑制剂的高通量筛选模型，从真菌的代谢产物中筛选分离到两个活性化合物2264 A和B。通过结构解析确定化合物2264 A、B分别为cyclopenol、viridicatol。这两个化合物是从青霉菌中首次分离得到的，其中cyclopenol具有较弱的抗菌活性［13］。两个化合物生物活性的相关报道很少，本研究发现2264 A和B对IMPDH显示较好的抑制活性，IC50值分别为69.68、11.86μmol/L；体外脾淋巴细胞增殖实验显示2264 A、B分别在322.6和65.8μmol/L浓度下可完全抑制由ConA活化的脾淋巴细胞增殖，说明2264 A、B在分子水平和细胞水平方面活性表现一致。下一步我们将对2264 A和B进行进一步免疫药理方面的研究和结构优化工作，开发其潜在的免疫抑制活性。

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