β?内酰胺类抗生素对L1型金属β?内酰胺酶的稳定性及酶动力学研究
【摘要】 目的 通过比较9种β?内酰胺类抗生素对L1型金属β?内酰胺酶(金属酶)的稳定性及酶动力学参数，了解金属酶L1的酶学特性。方法 制备金属酶L1的纯化产物，以紫外分光光度计测定9种β?内酰胺类抗生素对L1型金属酶的稳定性及酶动力学参数。结果 重组L1酶水解青霉素及碳青霉烯类抗生素的能力接近，氨曲南及头孢他啶对L1酶高度稳定。结论 L1酶的稳定性及动力学研究为指导临床合理应用抗生素提供了的理论依据。
【关键词】 β?内酰胺类抗生素； L1型金属酶； 稳定性； 酶动力学
ABSTRACT Objective To investigate the stability of β?lactams to L1 metallo?β?lactamase and its enzyme kinetic parameters. Methods The L1 fusion protein was expressed and purified from the recombinant E.coli. The stability and kinetic parameters of 9 β?lactams to L1 were detected by spectrophotometer. Results Recombinant L1 showed the similar hydrolyzing capacity to penicillin and carbapenems, but highly stable against aztreonam and ceftazidime. Conclusion The stability and enzyme kinetics of 9 β?lactams to L1 metallo β?lactamase provided a guideline for the clinical use of antibiotics.
KEY WORDS β?lactams; L1 metallo β? lactamase; Stability; Enzyme kinetic
嗜麦芽寡养单胞菌是一种条件致病菌，主要感染免疫力低下或长期大量使用广谱抗生素者。该菌以往在临床上并不常见，但近10年来，由它引起的感染逐渐增多，已成为临床院内感染的重要致病菌之一。产生L1型金属酶是嗜麦芽寡养单胞菌对β?内酰胺类抗生素耐药的重要原因。在本实验的前期工作阶段，通过聚合酶链反应从临床分离的嗜麦芽寡养单胞菌710株的基因组中扩增得到编码L1酶的全基因产物，并将其转入大肠埃希菌BL21(DE3)中克隆表达，得到重组菌MBL20［1］。本实验中，将重组菌表达的L1融合蛋白进行纯化，并测定9种β?内酰胺类抗生素对L1酶的稳定性及动力学参数，以了解L1型金属酶的酶学特性，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
青霉素G(penicillin G，PCG，华北制药集团)；头孢呋辛(cefuroxime，CXM，深圳制药厂)；头孢唑林(cefazolin，CEZ，西南药业股份有限公司)；头孢他啶(ceftazidime，CAZ，Glaxo公司)；亚胺培南/西司他丁(imipenem/cliastatin，IMP，美国Merck Sharp?Dohme药厂)；美罗培南(meropenem，MRP，日本住友制药株式会社)；氨曲南(aztreonam，AZ，上海施贵宝制药有限公司)；氨苄西林(ampicillin，ABPC，山东鲁抗医药有限公司)； 头孢噻肟(cefotaxime， CTX， HoechstMarion Roussel公司)；Nitrocefin为英国Glaxo研究所产品。 二甲基胂酸钠(sodium cacodylate)为上海生工公司产品。
1.2 菌株
产L1型金属酶的重组菌株MBL20。
1.3 仪器
超声细胞破碎仪(宁波新芝仪器厂)；5408R型台式高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；UV?120型紫外分光光度计(日本岛津公司)；气浴恒温振荡器(Edmund Bhler公司)。
1.4 L1融合蛋白的表达及纯化
挑取含重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)单菌落接种于2ml含25mg/L卡那霉素的LB肉汤中，37℃过夜培养，然后按1∶100的比例转入新鲜LB肉汤，于37℃ 250r/min振荡培养至A600=0.6时，加入异丙基硫代β?D?半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为1.0mmol/L。继续培养6h，菌液经10000r/min离心30min，收集菌体，以Ni?NTA柱纯化表达蛋白。纯化产物经12%十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)证实。
1.5 确定各底物的最佳测定波长
以50mmol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.0)配制9种β?内酰胺类抗生素溶液，使药物终浓度为10-4mol/L。参照［2，3］，确定各底物的最佳测定波长分别为：青霉素G 205nm，氨苄西林214nm，头孢唑林260nm，头孢呋辛265nm，头孢噻肟257nm，头孢他啶255nm，亚胺培南299nm，美罗培南299nm，氨曲南295nm。
1.6 9种抗生素对β?内酰胺酶的稳定性测定
取10-4mol/L底物2ml加酶液10μl，另取2ml底物加50mmol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.0)10μl，混匀后在37℃恒温水浴反应2h。以50mmol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH7.0)参比管为对照，在相应波长处测定加酶前各底物的A值，分别以缓冲液加酶液作对照，测定酶反应后底物的A值，根据反应前后A值变化，酶对各种底物的水解率：
水解率=(底物A值-底物加酶后A值)底物A值×100%
以青霉素G的水解率为100%，分别计算其它β?内酰胺类抗生素的相对水解率。酶稳定性实验均重复3次，以其A值之均数计算相对水解率［4］。
1.7 L1酶的米氏常数和最大反应速度［2～4］
在25℃，pH7.0条件下将不同浓度的底物(2.5～100μmol/L)与酶立即混匀，在各底物最佳波长处进行时间扫描5min，绘制反应?时间曲线。抗生素在酶水解作用下吸光度随时间下降，选择反应初始吸光度值下降和反应时间呈线性关系(即ΔA/Δt为恒定值)的区段，作为酶水解不同浓度底物的初速度V0。采用Lineweaver?Burk(L?B)法作图，计算各种酶对不同底物的米氏常数(Km)、最大反应速度(Vmax)值和相对水解效率(Vmax/Km值)。
2 结果
2.1 L1融合蛋白的表达及纯化
SDS?PAGE电泳结果显示，与空载体及重组菌诱导前表达产物对照，重组菌经IPTG诱导6h后可见特异性表达条带(图1)，此为谷胱甘肽转移酶(GST)和L1的融合蛋白，分子量为53.6ku，除去GST的分子量约25.8ku，L1分子量为27.8ku。
2.2 9种β?内酰胺类抗生素对L1酶的稳定性结果
结果表明，L1酶能有效水解碳青霉烯类抗生素亚胺培南及美罗培南，相对水解率均达到90%以上，与青霉素G的水解率接近；L1酶能有效水解除头孢他啶以外的其他头孢菌素，但其对头孢菌素的相对水解率较碳青霉烯类的水解率低。氨曲南及头孢他啶对L1酶非常稳定(表1)。
2.3 L1型金属β?内酰胺酶的动力学特征
重组L1型金属β?内酰胺酶对9种β?内酰胺类抗生素的水解动力学结果见表2。结果表明，L1酶除对氨曲南和头孢他啶没有明显水解作用外，对其它7种β?内酰胺类抗生素均有不同程度的水解作用。对青霉素、第一代头孢菌素头孢唑林及碳青霉烯类抗生素的相对最大水解速度及相对水解效率均较高，而对第二、三代头孢菌素的相对最大水解速度及相对水解效率均较低。
M：蛋白分子量Marker； 1：空载pET?41a(+)E.coli
BL21(DE3)经IPTG诱导6h； 2：含重组质粒pET?41a
(+)/L1的E.coli BL21(DE3)诱导前； 3：含重组质粒
pET?41a(+)/L1的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导6h；
4：纯化的融合蛋白L1
图1 SDS?PAGE检测L1酶的表达及纯化产物 表1 9种β?内酰胺类抗生素对L1酶的稳定性表2 L1型金属β?内酰胺酶的动力学特征
3 讨论
β?内酰胺酶是能催化水解6?氨基青霉烷酸(6?APA)、7?氨基头孢烷酸(7?ACA)及其N?酰基衍生物分子中β?内酰胺环的酰胺键的灭活酶，是大多数致病菌对β?内酰胺类抗生素耐药的重要原因［5］。
嗜麦芽寡养单胞菌所产L1型金属酶在日本、英国、意大利及均有发现［1，6～10］。金属β?内酰胺酶因水解底物谱广，且能水解碳青霉烯类抗生素而倍受关注。根据金属酶的生化分类和生化性质1995年Bush等［11］将金属酶全部归入功能类型3群，L1型金属酶属Bush分类的3a亚群，该亚群包括绝大多数金属酶，其特点是底物谱宽，水解亚胺培南的速度与水解青霉素的速度相近，还能有效水解头孢菌素，故临床危害极大。
本实验将9种临床常用β?内酰胺类抗生素对L1型金属酶的稳定性进行比较，结果表明，除第三代头孢菌素头孢他啶外，L1能有效水解其余第一、二及三代头孢菌素，并能有效水解碳青霉烯类抗生素，但对氨曲南无水解作用。超广谱β?内酰胺酶不能有效水解碳青霉烯类抗生素，但对氨曲南有不同程度的水解。这是金属酶与超广谱β?内酰胺酶的显著区别之一。
传统酶稳定性实验方法只在单一底物浓度下测定酶对抗生素的相对水解率，只表示实验所用底物浓度下酶对底物的水解情况，所得结论有一定局限性。我们通过对L1酶动力学的进一步研究，有助于了解酶与底物的亲和力及酶对底物的水解速率，对β?内酰胺类抗生素的稳定性作出定量比较，因此所得结论更可信。
Km代表酶与底物的亲和力，Km越小，亲和力越大，反之则亲和力越小。Vmax代表酶对底物的最大水解速度，通常用来反映β?内酰胺抗生素对酶的稳定性，Vmax越小就越稳定，但这仅限于酶被高浓度底物饱和的条件，因为β?内酰胺酶的水解率随底物浓度的变化而变化，其关系服从米曼氏方程：
V=Vmax［S］/(Km+［S］)
因此，Km和Vmax共同决定酶的动学力行为，Vm/Km较单独的Vmax或Km更为完善的参数，这一比值称之为生理效率或水解效率，此比值优点在于其综合反映了底物的亲和力(Km)和酶对底物的水解能力(Vmax)。
本实验酶动力学结果与酶稳定性实验结果基本一致。氨曲南对金属酶L1表达产物高度稳定。L1酶对青霉素及碳青霉烯类的相对水解效率在70%以上，较头孢菌素类抗生素的水解率高，但L1对氨苄西林的相对水解效率较低，仅为30.1%。在所测的9种β?内酰胺类抗生素中，L1酶与第三代头孢菌素头孢噻肟的亲和力最高，但由于其最大水解速度较低，故其相对水解效率(Km/Vm=36.7)并不高。对头孢菌素而言，第一代头孢菌素头孢唑林的水解效率最高，酶稳定性最差；第二代头孢菌素头孢呋辛较第三代头孢菌素头孢噻肟稳定，头孢他啶与L1酶的亲和力最小，水解速度最低，故酶稳定性最好。
碳青霉烯类抗生素是目前抗菌谱最广、产β?内酰胺酶革兰阴性菌感染疗效最好的β?内酰胺类抗生素之一。但有报道称，金属酶的产生率与临床碳青霉烯类药物的使用密切相关［12］。因此，在积极开发新药及酶抑制剂的同时，加强细菌耐药性的监测，避免滥用抗生素显得尤为重要。本实验对金属酶L1的酶学特性做了较为系统的研究，为指导临床用药提供了科学的理论依据。
【】
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