红树植物卤蕨内生真菌Penicillium sp. 0935030中的抗菌活性成分研究

                作者：崔海滨 梅文莉 缪承杜 林海鹏 洪葵 戴好富

【摘要】  为研究红树林植物卤蕨(Acrostichum aureurm)内生真菌Penicillium sp.0935030发酵物中的抗菌活性成分，采用活性追踪的方法，用多种色谱技术对化合物进行分离纯化，通过理化性质和光谱数据鉴定出7个化合物，分别为：环(脯氨酸?苏氨酸)(1)，环(脯氨酸?酪氨酸)(2)，1?呋喃基?1，2?乙二醇(3)，(3β，4β，22β)?12?烯?3，22，23?三羟基?齐墩果烷(4)，甘露醇(5)，尿苷(6)和甘草素(7)。以上化合物均为首次从该真菌中分离得到。用滤纸片琼脂扩散法测定上述化合物的抗菌活性，其中化合物1、2和7具有明显抗金葡菌和耐甲氧西林金葡菌活性。

【关键词】  卤蕨； 内生真菌； 青霉属； 环二肽； 抗菌活性

    ABSTRACT  To study the antibacterial constituents from the fermentation broth of endophytic fungus Penicillium sp. 0935030 from mangrove plant Acrostichum aureurm. The separation procedure was guided by antibacterial bioassay. Seven compounds were isolated and purified by column chromatography, and their structures were identified as cyclo (Pro?Thr) (1), cyclo (Pro?Tyr) (2), 1?(2?Furanyl)?1,2?ethanediol (3), (3β,4β,22β)?olean?12?ene?3,22,23?triol (4), mannitol (5), uridine (6), and liquiritigenin (7) by physicochemical and spectral data. All compounds were isolated from this fungus for the first time. Antibacterial activities of all the compounds were assayed by paper disk diffusion method, and compounds 1, 2, and 7 showed inhibitory effect on Staphylococcus aureus and methicillin?resistant Staphylococcus aureus.

    KEY WORDS  Acrostichum aureurm;  Endophytic fungus;  Penicillium Thom;  Cyclic dipeptide; Antibacterial activity

     红树林(mangrove)是生长在热带和亚热带潮间带的一种特殊的常绿植物群落，它包括了陆地和水体两个生态系统［1］。红树植物及其内生真菌为适应这一特殊生境，其生理特性和代谢途径有其自身的特性，并产生出多种类型的次生代谢产物，现已成为寻找生物活性成分的重要资源［2］。自1961年Jevons［3］发现了第一株耐甲氧西林金葡菌(methicillin?resistant Staphy?lococcus aureus，MRSA)，至今MRSA已成为全球感染的重要病原菌之一。MRSA具有广谱耐药性，其所致感染的是临床十分棘手的难题，寻找有效治疗MRSA的新抗生素已经成为当今医药界的重要任务［4］。

    本研究组在对红树植物共附生微生物的培养物进行生物活性筛选过程中， 发现红树林植物卤蕨(Acros?tichum aureurm)内生真菌Penicillium sp.0935030的发酵液显示出抗MRSA活性。为了寻找其中的抗菌活性成分，以MRSA、金葡菌和白念珠菌为模型，在活性筛选指导下，从该发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离得到7个化合物，经MS、NMR、1H?1H COSY、HMQC和HMBC等鉴定其结构分别为：环(脯氨酸?苏氨酸)(1)、环(脯氨酸?酪氨酸)(2)、1?呋喃基?1，2?乙二醇(3)、(3β，4β，22β)?12?烯?3，22，23?三羟基?齐墩果烷(4)、甘露醇(5)、尿苷(6)和甘草素(7)。以上化合物均为首次从该真菌中分离得到，其中化合物1、2和7具有明显抗MRSA和金葡菌的活性(Fig.1)。

    1  材料与方法

    1.1  试验试剂和仪器

    熔点用北京泰克仪器有限公司生产的X?5型显微熔点仪测定(未校正)。旋光在JASCO?20C数字旋光仪上测定；MS用VG Autospec?3000型质谱仪测定；NMR用Bruker av?400超导核磁仪测定，以TMS为内标；薄层层析硅胶和柱层析硅胶均为青岛海洋化工厂产品；Sephadex LH?20为Merck公司产品；GJ?100BE发酵罐(江苏镇江生物仪器公司)；硫酸卡那霉素(上海生工有限公司)，氟康唑(贵州科伦药业有限公司，批号A050314?04)，其它试剂均为分析纯。

    供试菌株MRSA ATCC9551由英国Heriot Watt大学Burgess博士提供；金葡菌(Staphylococcus aureus)ATCC51650和白念珠菌(Candida albicans)ATCC10231购于海南省药品检验所。

    MRSA和金葡菌采用牛肉膏蛋白胨培养基［5］：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，定容至1L，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min；白念珠菌采用YPD培养基［6］：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂20g，定容至1L，pH7.0，121℃灭菌20min。

    1.2  菌株的分离与培养

    (1)菌株  菌株093503分离自海南文昌清澜港红树林植物卤蕨(Acrostichum aureurm)的根，植物样品由热带农业院热带生物技术研究所代正福副研究员鉴定为卤蕨，菌株093503由中国热带农业科学院热带生物技术研究所洪葵教授研究组鉴定为青霉属，初筛具有抗MRSA活性。菌种保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

    (2)培养

    改良Martin培养基［5］  葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4　1g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂20g，50%陈海水定容至1L，pH7.2，121℃灭菌30min。

    黄豆粉发酵培养基［7］  可溶性淀粉20g，蛋白胨2g，酵母粉5g，黄豆粉15g，NaCl 4g，CaCO3 4g，50%陈海水定容至1L，pH7.2～7.4，121℃灭菌25min。

    青霉093503经Martin培养基平板活化，接种于黄豆粉种子培养基中，28℃，180r/min振荡培养3d，按1%接种量接种到70L黄豆粉发酵培养基，发酵罐28℃培养7d。发酵2批，发酵液共140L。

    1.3  活性测试

    (1)生物活性测试方法［8］  将样品配成浓度为10mg/ml的溶液，加样品溶液50μl于直径6mm的灭菌滤纸圆片上，待溶剂挥干后，将已点样的滤纸圆片贴于已涂供试菌悬液100μl(菌液浓度105～107cfu/ml)的琼脂培养基上，放置20min，再放入培养箱中37℃无光照培养，24h后测其抑菌圈大小，每个样品做三个重复。金葡菌和MRSA以硫酸卡那霉素，白念珠菌以氟康唑作为阳性对照。

    (2)有效组分提取液的确定  取菌株093503的菌丝体1.0g，用甲醇浸提2次得到提取物A。同时取发酵液100ml，减压浓缩蒸干后得到提取物B。提取物A和B的活性测试结果表明，提取物B显示出抗菌活性。将发酵液的提取物(B)配成5mg/ml的蒸馏水混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取并测试活性。结果表明乙酸乙酯萃取物具有与粗提物相应的生物活性，故确定乙酸乙酯提取物为活性提取物。

    1.4  提取与分离

    青霉093503发酵液140L经纱布过滤得菌丝体和发酵上清液。将发酵上清液于45℃减压浓缩至5L，依次用低沸点石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩分别得到石油醚浸膏(1.2g)、乙酸乙酯浸膏(17.0g)和正丁醇浸膏(25.0g)。乙酸乙酯浸膏(17.0g)经硅胶柱层析，以石油醚?丙酮梯度洗脱得到10个流份(Fr.1?10)，每个组分经上述活性测试方法进行活性测试，确定组分Fr?8和Fr?10为活性组分。活性组分再经反复硅胶柱色谱、Sephadex LH?20柱色谱，分别得到化合物1(10.5mg)，化合物2(20.9mg)，化合物3(14.7mg)，化合物4(38.3mg)，化合物5(303.5mg)，化合物6(5.0mg)和化合物7(6.7mg)。

    2  结果与讨论

    2.1  化合物的结构鉴定

    化合物1  白色粉末，体积分数10%的硫酸显红色，［α］18D=-115°(c 0.3，MeOH)。在正离子FAB?MS中，出现准分子离子峰199［M+1］+(基峰)，结合13C?NMR(DEPT)谱，确定其分子式为C9H14N2O3。1H?NMR(400MHz，CD3OD)δ：4.29(1H，m，β?HThr)，4.20(1H，m，α?HThr)，3.97(1H，m，α?HPro)，3.55(1H，m，δ?HPro)，3.48(1H，m，δ?HPro)，2.30(1H，m，β?HPro)，1.99(2H，m，γ?HPro)，1.87(1H，m，β?HPro)，1.33(3H，d，J=6.5Hz，γ?HThr)；13C?NMR(100MHz，CD3OD)δ：172.0(CO)，167.0(CO)，67.0(β?CThr)，61.3(α?CThr)，60.2(α?CPro)，46.2(δ?CPro)，29.5(β?CPro)，23.3(γ?CPro)，20.3(γ?CThr)。与［9］对照数据基本一致，因此确定化合物1为环(脯氨酸?苏氨酸)。

    化合物2  白色粉末，体积分数10%的硫酸显红色，［α］18D=(145°(c 1.0，H2O)。红外光谱IRνKBrmax：3418，1704，1600，1513，1444，1370cm-1。在正离子FAB?MS中，出现准分子离子峰261［M+1］+(基峰)，结合13C?NMR(DEPT)谱，确定其分子式为C14H16N2O3。1H?NMR(400MHz，CD3OD)δ：7.04(2H，d，J=8.4Hz，2′，6′?HTyr)，6.70(2H，d，J=8.4Hz，3′，5′?HTyr)，4.35(1H，t，J=6.2Hz，α?HTyr)，4.03(1H，dd，J=6.2，10.0Hz，α?HPro)，3.51～3.56(1H，m，δ?HPro)，3.30～3.36(1H，m，δ?HPro)，3.05(2H，dd，J=5.2，9.2Hz，β?HTyr)，2.06～2.10(1H，m，β?HPro)，1.78～1.80(2H，m，γ?HPro)，1.19～1.23(1H，m，β?HPro)；13C?NMR(100MHz，CD3OD)δ：170.8(CO)，167.0(CO)，157.9(C?4′)，132.1(C?2′，6′)，127.7(C?1′)，116.2(C?3′，5′)，60.1(α?CPro)，57.9(α?CTyr)，45.9(δ?CPro)，37.7(β?CTyr)，29.4(β?CPro)，22.8(γ?CPro)。与［10］氢谱数据一致，因此确定化合物2为环(脯氨酸?酪氨酸)。

    化合物3  黄色油状，体积分数10%的硫酸显蓝黑色。［α］18D=+33.5°(c 2.4，CHCl3)，EI?MSm/z：128［M］+，110，97，81，69，53，40；1H?NMR(400MHz，CD3OD)δ：7.44(1H，m，5?H)，6.31～6.36(2H，m，3，4?H)，4.67(1H，t，J=5.6Hz，2′?H)，3.76(2H，d，J=5.6Hz，1′a，1′b?H)；13C?NMR(100MHz，CD3OD)δ:156.3(C?2)，111.2(C?3)，143.2(C?4)，107.7(C?5)，65.8(C?1′)，69.6(C?2′)。化合物3的1H?NMR与文献［11］的数据基本一致，确定化合物3为1?呋喃基?1，2?乙二醇。

    化合物4  无色结晶(甲醇)，体积分数10%的硫酸显红色。EI?MS m/z：458［M］+(100)。1H?NMR(400MHz，acetone?d6)：δ0.88(3H，s)，0.89(3H，s)，0.94(3H，s)，0.98(3H，s)，1.05(3H，s)，1.15(3H，s)，1.20(3H，s)，5.24(1H，t，J=3.6Hz，12?H)；13C?NMR(100MHz，acetone?d6)δ：39.3(C?1)，28.0(C?2)，80.7(C?3)，43.4(C?4)，56.7(C?5)，19.3(C?6)，33.9(C?7)，40.5(C?8)，48.6(C?9)，37.5(C?10)，24.4(C?11)，122.9(C?12)，145.4(C?13)，42.3(C?14)，26.7(C?15)，28.3(C?16)，38.1(C?17)，45.9(C?18)，47.3(C?19)，31.1(C?20)，42.8(C?21)，76.1(C?22)，23.2(C?23)，64.7(C?24)，16.5(C?25)，17.3(C?26)，25.7(C?27)，28.5(C?28)，33.2(C?29)，21.2(C?30)。化合物4的13C?NMR数据与文献［12］基本一致，确定化合物4为(3β，4β，22β)?12?烯?3，22，23?三羟基?齐墩果烷。

    化合物5  无色针状结晶(甲醇)，体积分数10%的硫酸不显色，高锰酸钾显黄色，mp 166℃～168℃。负离子ESI?MS显示准分子离子峰为m/z：181［M?H］-。1H?NMR(400MHz，DMSO?d6)δ：4.39(2H，d，J=5.2Hz)，4.31(2H，t，J=5.1Hz)，4.12(2H，d，J=7.0Hz)，3.61(2H，m)，3.55(2H，t，J=7.4Hz)，3.45(2H，m)，3.38(2H，m)；13C?NMR(100MHz，DMSO?d6)δ：71.3，69.8，63.8。从化合物3的13C?NMR数据可知该化合物有一定的对称性，其特征与甘露醇的谱图特征一致；其1H?NMR数据与文献［13］的数据基本一致，确定化合物5为甘露醇。

    化合物6  白色粉末(甲醇)，体积分数10%的硫酸显红色，ESI?MSm/z：252［M+Li］+，156。1H?NMR(400MHz，CD3OD)δ：8.01(1H，d，J=8.0Hz，6?H)，5.93(1H，d，J=4.5Hz，1′?H)，5.91(1H，d，J=8.0Hz，5?H)；13C?NMR(100MHz，CD3OD)δ：152.5(C?2)，166.2(C?4)，102.7(C?5)，142.8(C?6)，90.8(C?1′)，75.8(C?2′)，71.4(C?3′)，86.4(C?4′)，62.3(C?5′)。与文献［14］报道的尿苷数据相符，确定化合物6为尿苷。

    化合物7  黄色固体，体积分数10%的硫酸显淡黄色，mp 200℃～202℃，［α］18D=(35.5°(c 2.4，MeOH)。1H?NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.72(1H，d，J=8.8Hz，5?H)，7.31(2H，d，J=8.4Hz，2′，6′?H)，6.82(2H，d，J=8.4Hz，3′，5′?H)，6.49(1H，dd，J=8.8，2.4Hz，6?H)，6.36(1H，d，J=2.0Hz，8?H)，5.36(1H，dd，J=13.2，2.8Hz，2?H)，3.04(1H，dd，J=16.8，13.2Hz，3?H)，2.70(1H，dd，J=16.8，2.8Hz，3?H)；13C?NMR(100MHz，CDCl3)δ：78.9(C?2)，42.9(C?3)，191.5(C?4)，127.8(C?5)，109.8(C?6)，164.6(C?7)，101.8(C?8)，163.4(C?9)，112.9(C?10)，129.2(C?1′)，126.9(C?2′)，114.4(C?3′)，156.8(C?4′)，114.4(C?5′)，126.9(C?6′)。化合物7的1H?NMR和13C?NMR数据与文献［15］基本一致，确定化合物7为甘草素。

    2.2  抗菌活性

    采用滤纸片琼脂扩散法测定化合物的抗菌活性(表1)，结果表明化合物1、2和7对MRSA和金葡菌有明显抑制作用，对白念珠菌则没有表现出活性。其余化合物均没有表现出对MRSA、金葡菌和白念珠菌的活性。表1    化合物1、2和7对两种病源菌的抑菌圈直径许多天然环二肽化合物都具有明确的生物活性，例如作为抗生素，苦味剂，植物生长抑制剂以及激素释放抑制剂等［16］。在已发现的天然环二肽中，Thr出现频率很低，环(Pro?Thr)作为苦味剂被研究过；环(Pro?Tyr)在细菌、真菌中均有发现，具有诱导生物发光和色素产生的活性［17］。本研究首次报道环(Pro?Thr)和环(Pro?Tyr)对MRSA和金葡菌具有抑制活性，因此，对于环二肽类化合物的生物活性有待于进一步深入研究。文献报道甘草素有抗菌和解痉作用，能抑制单胺氧化酶，可精神抑郁病［18］，本次研究发现甘草素对MRSA和金葡菌亦显示出抑制活性。

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