苯安莎类抗生素的一种早期鉴别方法
作者：刘爱明 武临专 王以光 张会图 赫卫清 李永海 张侃
【摘要】 目的 建立一种对苯安莎类抗生素特异的颜色反应早期鉴别方法。方法 根据碱性处理苯安莎类抗生素，使其安莎链与苯环连接的酰胺键开裂后化合物呈紫色的原理，建立了将发酵液粗提品进行薄层色谱层析后采用2.0mol/L NaOH溶液喷涂显色的早期鉴别方法；以格尔德霉素为例，在硅胶板上的检测灵敏度为4μg。结论 采用该颜色鉴别反应方法：①对两株确证为新的格尔德霉素产生菌Streptomyces sp. 4?4以及Streptomyces sp. 3?57进行了佐证；②对吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997的一株格尔德霉素生物合成后修饰基因阻断变株CT?1中产生的格尔德霉素前体物及其类似物，在硅胶板上进行了快速定位和初步鉴别。
【关键词】 苯安莎类抗生素； 酰胺键； 颜色反应； 鉴别
ABSTRACT Objective Establishing a simple and sensitive method for early preliminary discrimination of benzenic ansamycins and their derivatives. Method Most natural benzenic ansamycins are yellow compounds, some are white or colorless compounds. After treatment of alkali such as NaOH or sodium methoxide, which breaks the amide bond formed between the benzenic amino?group and the ansa?bridge′s terminal carboxy?group, benzenic ansamycins such as geldanamycin changed its color from yellow to purple. The minimal detection limit of this method on the silica gel plate for geldanamycin was 4μg with NaOH (2.0mol/L) sprayed. Results This color change reaction method was used successfully for early preliminary discrimination of geldanamycin produced by two soil?isolated novel strains, Streptomyces sp. 4?4 and Streptomyces sp. 3?57, with ansamycin producing potential(s), and fast location and preliminary discrimination on silica gel plate of geldanamycin derivatives produced by CT?1, a mutant strain of Streptomyces hygroscopicus 17997 with one of the geldanamycin biosynthetic tailoring genes being disrupted.
安莎类抗生素具有重要的生物学活性，例如，利福霉素是目前临床上最重要的抗结核病药物之一；格尔德霉素(geldanamycin)具有抗肿瘤和抗病毒活性等。安莎类抗生素还具有抗细菌(革兰阳性菌)、抗霉、抗酵母和抗原虫等活性。因此，安莎类抗生素日益受到人们的重视。
安莎类抗生素为一个脂肪链(称为安莎桥)连接于芳香环的两个不相邻原子间的一类化合物，其中的芳香环有苯环和萘环两种，所以安莎类抗生素可以分为苯安莎类抗生素(例如格尔德霉素)和萘安莎类抗生素(例如利福霉素)两种。在已知的安莎类抗生素中，无论是苯安莎类抗生素还是萘安莎类抗生素，其安莎桥的一端均通过酰胺键与芳香环相连(迄今唯有萘安莎类抗生素红迪菌素例外，其酰胺键上的羰基被进一步还原)。
在微生物次级代谢产物筛选的过程中，陆续有安莎类抗生素被发现的报道。例如，GlaxoWellcome公司的Stead等［1］在筛选抗制癌蛋白M抑制剂的过程中从一株链霉菌的次级代谢产物中发现了一组格尔德霉素类似物，日本的Hosokawa等［2，3］在筛选肿瘤细胞系的生长抑制剂中获得了噻唑三烯霉素(thiazinotrieno?mycins)，Kakeya等［4］在筛选白血病细胞系IL?60的细胞凋亡诱导剂中得到了胞三烯菌素A(cytotrienin A)。除莠霉素和格尔德霉素都是较早发现的苯安莎类抗生素，具有除草、抗菌、抗肿瘤和抗病毒等活性；格尔德霉素由于其优越的抗肿瘤活性，目前受到重视；在国内，胡海峰［5］、朱宝泉［6］等在免疫抑制剂的筛选过程中获得了除莠霉素A及其产生菌和格尔德霉素及其产生菌。但是至今还没有见到有关安莎类抗生素早期鉴别方法的报道。
本文作者所在实验室根据安莎类抗生素的生物合成原理，建立了一种专门针对安莎类抗生素产生菌的分子筛选模型。从土壤分离的约1900株未知放线菌中筛选得到了一批具有产生安莎类抗生素潜能的放线菌［7］，这些菌株的发酵产物绝大多数具有抗菌、抗病毒或抗肿瘤活性。如何从这些阳性菌株的发酵产物中快速、准确地鉴别安莎类抗生素，显得特别重要和迫切。
多数安莎类抗生素具有颜色(多为黄色)，安莎桥中含有三烯键的安莎类抗生素具有特征性的紫外吸收峰(268、278和290nm)；这些性质对于鉴别安莎类抗生素有一定帮助，但不能够作为比较可靠的、早期鉴别安莎类抗生素的方法。安莎类抗生素的分子结构中，安莎桥的一端通过酰胺键与芳香环相连。Schnur等［8］利用甲醇钠(一种强碱)使格尔德霉素的酰胺键开裂，产生了紫色化合物(图1)。我们推测NaOH同样具有开裂格尔德霉素的芳香环与安莎桥之间形成的酰胺键作用。杨红玲等［9］在除莠霉素A(herbimycin A)结构类似物的分离鉴定中提及用碱处理除莠霉素A及其衍生物可以产生紫色化合物。
格尔德霉素和除莠霉素A均属于苯安莎类抗生素。通过碱性处理使苯安莎类抗生素中芳香环与安莎桥之间形成的酰胺键开裂、产生紫色化合物，有可能成为早期鉴别苯安莎类抗生素的一个特异性颜色反应方法。本文表明该颜色反应可用于具有产生安莎类抗生
图1 CH3ONa打开格尔德霉素的芳香环与安莎桥之间形成的酰胺键素潜能的放线菌发酵液粗提物的分析，并在苯安莎类抗生素(格尔德霉素)的生物合成基因阻断变株发酵产物的早期鉴别中，也发挥了显著作用。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)菌株 Streptomyces hygroscopicus 17997?CT?1，格尔德霉素生物合成后修饰基因阻断变株［10］(原株具有格尔德霉素产生能力)；链霉菌Streptomyces sp. 4?4以及Streptomyces sp. 3?57为从土壤中分离的2株发酵产物未知的链霉菌(AHBA合酶基因筛选阳性菌株)［7］；这些菌株均为本实验室保存菌株。
(2)试剂 甲醇钠(sodium methoxide，anhydrous powder)为ACROS ORGANICS公司试剂。NaOH为国产分析纯化学试剂。格尔德霉素对照品，本实验室自备。利福霉素SV标准品购自药品生物制品检定所。硅胶板为青岛海洋化工厂分厂GF254产品和德国Merck公司Silica Gel 60 F254产品。
1.2 方法
取一定量格尔德霉素对照品或待测菌株发酵上清液的乙酸乙酯提取物，溶于无水甲醇中，点样于硅胶板上，在乙酸乙酯∶二氯甲烷∶正己烷∶甲醇(9∶6∶6∶1)溶媒系统中展层。展层结束后，用少量NaOH(2.0mol/L)溶液进行喷涂，观察TLC平板上的颜色变化，照相记录。
取一定量格尔德霉素对照品或待测菌株发酵上清液的乙酸乙酯提取物，溶于无水甲醇中，于玻璃试管或eppendorf管中直接加入约等质量的NaOH(浓度为2.0mol/L)或甲醇钠(固体粉末，或者其甲醇溶液)，观察颜色变化，采用上述溶媒系统进行硅胶板展层分析。
2 结果与讨论
2.1 格尔德霉素的显色反应
格尔德霉素对照品不同量(4、8、16、32μg)在硅胶板上用NaOH(2.0mol/L)喷涂后的显色。可以看出，格尔德霉素用碱处理后的显色反应检测灵敏度(4μg)高于其本身具有的颜色。
2.2 三株链霉菌发酵上清液乙酸乙酯提取物中苯安莎类抗生素的早期鉴别
两株链霉菌菌株Streptomyces sp. 4?4和Streptomyces sp. 3?57，是本文作者实验室采用AHBA合酶基因PCR筛选模型获得的AHBA合酶基因阳性菌株，推测具有产生安莎类抗生素的可能性；吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997 CT?1为格尔德霉素生物合成后修饰基因阻断变株(简称CT?1)，推测仍然具有合成格尔德霉素前体物的能力。这三株链霉菌的发酵上清液乙酸乙酯提取物在硅胶板上展层后用2.0mol/L NaOH喷涂前和喷涂后的显色反应(图2)，可以初步确定Streptomyces sp. 4?4和Streptomyces sp. 3?57两株菌发酵液中产生的与格尔德霉素对照品在硅胶板上Rf值相同的物质为格尔德霉素(化学分离与鉴定已证实它们为格尔德霉素，结果另文发表)。格尔德霉素生物合成后修饰基因阻断变株CT?1发酵液中的化合物CT?1?7，显示明显的紫色反应，提示其为格尔德霉素生物合成前体物(已经证实其为7?脱氨甲酰基?4，5?双氢格尔德霉素［10］)。变株CT?1发酵液中的化合物CT?1?1，在用2.0mol/L NaOH喷涂后，颜色逐渐变为偏红紫色。将化合物CT?1?1纯化后，硅胶板展层并进行2.0mol/L NaOH喷涂显色，结果也是逐渐变为偏红紫色，提示其为一个新的格尔德霉素类似物(已经证实其为一个新结构的格尔德霉素类似物，结果另文发表)。
3 讨论
对于NaOH作用于苯安莎类抗生素后的显色反应机制，本文作者曾以格尔德霉素为例进行了初步探索。格尔德霉素分别与甲醇钠(溶于甲醇)和NaOH(溶于水)于Eppendorf管中作用后，在乙酸乙酯∶二氯甲烷∶正己烷∶甲醇(9∶6∶6∶1)溶媒系统(需要滴加数滴冰乙酸，可将－COONa转换为－COOH)中展层后的紫色化合物Rf值(约0.30)基本相同(显著小于格尔德霉素本身的Rf值0.63)。在乙酸乙酯∶二氯甲烷∶正己烷∶甲醇(9∶6∶6∶1)溶媒系统中如果不滴加冰乙酸进行展层，那么NaOH作用于格尔德霉素后的部分(甚至全部)产物在硅胶板点样原点上保持不动的鉴别(NaOH喷涂后)(形成羧酸钠盐的缘故)。这些现象说明NaOH也是将格尔德霉素芳香环上的氨基与安莎桥上的羧基所形成的酰胺键开裂、产生紫色化合物(图1)。甲醇钠开裂酰胺键的反应机制是碱催化醇解，NaOH开裂酰胺键的反应机制是碱性条件下水解，二者作用于格尔德霉素后产生的紫色化合物是有细微结构差异的，但尚不至于造成硅胶板上Rf值显著差异。
NaOH用作硅胶板喷涂显色的效果明显好于甲醇钠，加上NaOH便宜、易得，因而采用NaOH溶液喷涂硅胶板显色更加、方便和有效。
格尔德霉素和除莠霉素A具有本文介绍的显色反应，这两个化合物均属于苯(醌型)安莎类抗生素。双氢除莠霉素A属于苯(酚型)安莎类抗生素，杨红玲等提及该化合物也具有遇碱显示紫色的反应［9］。本文作者推测，含有三烯键的苯(醌型)安莎类抗生素如安莎三烯(ansatrienin)［11］，也可能具有本文介绍的紫色反应。某些苯安莎类抗生素如部分柄型菌素(ansamitocin)类化合物，其芳香环与安莎桥之间的酰胺键被进一步修饰与取代，这类苯安莎类抗生素是否具有本文介绍的显色反应，尚不清楚。
不同的苯安莎类抗生素在酰胺键开裂的难易程度以及开裂后的化合物颜色方面可能会存在一定的差异。本文中的格尔德霉素类似物CT?1?1和CT?1?7分别为格尔德霉素的芳香环和安莎桥上发生修饰或变化后的衍生物。CT?1?7用NaOH喷涂后即刻显示紫色，CT?1?1用NaOH喷涂后约20min显示偏红紫色，提示苯安莎类抗生素芳香环上的取代基变化，不仅对酰胺键开裂后的化合物颜色有一定影响，对NaOH开裂酰胺键的速度也有影响；而苯安莎类抗生素安莎桥上的取代基变化对NaOH开裂酰胺键的速度以及酰胺键断裂后化合物的颜色影响较小。
由于微生物次级代谢产物化学结构的复杂性和多样性，本文介绍的颜色反应可能仅适用于已知具有安莎类抗生素产生潜能的放线菌所产生的次级代谢产物中苯安莎类抗生素的早期、初步鉴别和定位，如果用于从大量的放线菌次级代谢产物中早期发现苯安莎类抗生素，有可能会产生许多假阳性结果，因为遇碱变紫色的化合物并不一定都是苯安莎类抗生素；已知羟基醌类化合物在碱性溶液中也发生颜色改变，使颜色加深，多呈橙、红、紫红色及蓝色，羟基蒽醌类化合物遇碱显示红～紫红色(Borntrger′s反应)［12］。
本文作者曾经用甲醇钠和NaOH分别作用于萘安莎类抗生素——利福霉素SV样品(溶于甲醇，液体试管中反应)，未见紫色反应，硅胶板分析亦未见利福霉素SV的Rf值变化。萘安莎类抗生素的早期鉴别尚待进一步研究。
致谢：感谢医学院医药生物技术研究所化学合成室李卓荣研究员、王玉成研究员对本文部分实验结果的分析与解释。
【】
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