头孢他啶治疗下尿路及男性生殖系感染的疗效观察

                    作者：张业旺 谭强 刘瑞江 徐秀泉 徐希明 

【摘要】  6?氨基青霉烷酸(6?APA)是重要的抗生素药物中间体之一，目前均采用青霉素酰化酶酶促裂解青霉素获得。本文介绍近年来青霉素酰化酶催化青霉素水解的研究进展，青霉素酰化酶的性质及其催化机理，青霉素酰化酶的固定化方法，青霉素酰化酶反应器的设计，反应介质工程的研究进展。

【关键词】  青霉素酰化酶； 6?APA； 双水相系统； 水?有机相系统； 离子液体； 反应器设计

    ABSTRACT  As an important pharmaceutical intermediate in the production of β?lactam antibiotics, 6?aminopenicillanic acid is the product from enzymatic hydrolysis of penicillin with penicillin acylase. In this article, the recent development concering with the preparation of 6?APA by hydrolysis of penicillin, catalytic mechanism of penicillin acylase, immobilization techniques and their carriers, two?phase system for hydrolysis of penicillin, the design and optimization of bioreactor are reviewed.

    KEY WORDS  Penicillin acylase;  6?APA;  Aqueous two phase system;  Biphasic system;  Liquid inions;  Design of reactor

　 青霉素酰化酶(penicillin acylase，penicillin amidase，penicillin amidohydralse，EC 3.5.1.11)可以裂解青霉素获得重要的医药原料6?氨基青霉烷酸(6?APA)。在界中来源广泛，细菌、放线菌、酵母和高等真菌都可以产生青霉素酰化酶［1］。尽管有报道推测青霉素酰化酶是在代谢芳香族化合物作为碳源的过程中具有一定的作用［2］，但产生的机理仍未明确。随着化进程的，环境污染的加重，生物催化绿色浪潮随之兴起，青霉素酰化酶的应用越来越广泛，围绕着青霉素酰化酶酶促裂解青霉素制备6?APA的研究也备受关注，作为一种重要的工业酶，青霉素酰化酶在制备6?APA中的应用已经有近三十年的了。本文对这一方向近年来的发展做一综述。

    1  酶的性质及其催化机理

    根据青霉素酰化酶在催化水解反应时所偏爱的底物不同，可将青霉素酰化酶分为3类：青霉素G酰化酶、青霉素V酰化酶和氨苄西林酰化酶。近年来的研究发现，自然界仍然存在其它种类的青霉素酰化酶，如从放线菌Streptomyces lavendulae中分离到的青霉素酰化酶可以水解一些天然脂肪族的青霉素，因此可以定义为青霉素K酰化酶［3］。青霉素酰化酶催化水解的底物结构非常相近，但是青霉素酰化酶的结构上差别较大。来源于大肠埃希菌(Escherichia coli)的青霉素G酰化酶具有一个20.3ku的α亚基和一个68.4ku的β亚基［4］。来源于球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)的青霉素V酰化酶是四个34.7ku亚基组成的四聚体。这两类酶都是N末端亲核水解酶的大家族成员［5，6］，N末端亲核水解酶的共同点是在N末端具有催化残基。虽然青霉素V酰化酶的亲核残基是丝氨酸，青霉素G酰化酶的亲核残基是半胱氨酸，但是它们的折叠却是惊人的相似，都具有一个四层的催化活性αββα核心结构［7］。

    Duggleby等［4］通过对来源于大肠埃希菌的青霉素G酰化酶的研究发现，它具有唯一活性中心，两个亚基紧密交织在一起，组装成肾脏形，中间有一凹槽，杂二聚体的大小为7nm×5nm×5.5nm。两者之间没有明显的分离区域，亚基之间接触角痕大，20%为疏水氨基酸，酶与苯乙酸、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的结合部位位于底物侧链的结合部位。这些抑制剂的苯基部位直接伸到酶分子疏水袋。Metα142，Pheα146，Pheβ57，Trpβ154，Ileβ177位于疏水袋两侧，Serβ67封住疏水袋的底部袋口，由Serβ1和Asnβ241的侧链和β23，β69的主链氮原子组成。McVey等［8］采用多底物竞争性抑制，用X晶体衍射测定了底物苯乙酸、3，4二羟基苯乙酸、2，5二羟基苯乙酸、p?硝基苯乙酸等与青霉素酰化酶形成的复合物的三维结构，这些复合物结构揭示了底物结合区域构象的变化可能作为酶自催化的开关。结果发现Arg α263参与了与底物的结合并协助Asn β241的定位，Phe 146是底物进入活性中心的开关，酶活性高度依赖于Asn β241，在催化中心部位，β241 Asn会导致形成氧阳离子的洞，而且对底物与Ser β1也起到定位的作用，所以准确地说，青霉素酰化酶的催化活性中心是Ser?Asn二联体。青霉素酰化酶的水解青霉素G的机制是1995年由Duggleby等阐明［4］，其过程如图1所示。青霉素酰化酶主要由其β?亚基N?末端丝氨酸残基发挥水解酰基作用。酶促水解反应是通过酶活性中心和底物分子形成一个四面体中间物进行的，四面体中磺酸基团与半缩醛非常相似。且这一四面体形成和解体是一个可逆的过程，羰基的质子化使得其碳原子更容易受到亲核进攻。β?1?丝氨酸残基的Oγ处于利于进攻羰基碳原子的位置。

    丝氨酸的Oγ亲核进攻青霉素G的酰胺键羰基碳原子后形成一个氧负离子四面体中间物，通过β23和β69的主要酰胺基团及β241 Asn侧链的Nδ相互作用从而保持稳定，当释放6?APA时，这个四面体中间物就发生解体。接着酰化酶受到水分子的进攻而产生另一个四面体中间物，同样通过β23和β69的主要酰胺基团与β241Asn侧链的Nδ相互作用而稳定，当苯乙酸被释放时，同时这个四面体结构发生解体。

    2  青霉素酰化酶的固定化

    酶法生产6?APA大多采用固定化酶，固定化酶同游离酶相比具有明显的优点，比如高稳定性，可以重复使用或者连续使用，容易从反应液中分离，可以有效防止对产物的蛋白污染和微生物污染等。固定化酶的性

    图1    青霉素酰化酶催化水解青霉素G机理示意图［4］质取决于酶本身和固定化载体，两者相互作用赋予了固定化酶的生物化学、机械以及动力学等性质［9］。酶的固定化方法主要有吸附法、共价耦联法、包埋法和交联法，这些方法在青霉素酰化酶的固定化研究中都用应用，按照载体的类型主要分为有载体固定化和无载体固定化技术。

    在有载体固定化技术中，由于吸附法特异性低，固定化酶的不够稳定，蛋白质容易从载体上脱落，因此在青霉素酰化酶的固定化中使用越来越少。在共价耦联法中，固定化载体是研究的核心内容之一，Rhm公司在20世纪70年代推出的Eupergit C是最常用的环氧树脂载体，青霉素酰化酶在中性或者碱性的条件下通过亲核攻击使得酶的游离氨基同Eupergit C的环氧基相连［9］，获得的固定化酶稳定性很高，可使用800批后仍具有60%的初始活性［10］。Sephabeads FP?EP是另一类环氧基载体，在结构上同Eupergit C非常相似，表面的环氧基密度可高达100μmol/ml，这样酶和载体的相互作用很强，可以大大提高青霉素酰化酶的稳定性，在45℃下悬浮8d酶的活力没有明显损失［11］。Amberlite XAD?7是一种多孔聚甲基丙烯酯类树脂，在激活后具有游离的醛基，可以同酶发生共价耦联［12］。除了树脂外，还有醛琼脂糖凝胶［13］和明胶壳聚糖［14］也通常作为青霉素固定化的载体。青霉素酰化酶在无机载体如经过活化的硅胶［15，16］、分子筛等介孔材料［17～19］、硅藻土［20］等载体上的固定化研究也得到开展，在无机材料上固定化的优点是材料便宜易得。

    青霉素酰化酶也可以通过无载体的固定化技术来实现，交联酶晶体(cross?linked enzyme crystals，CLECs)和交联酶聚集体(cross?linked enzyme aggregates，CLEAs)是最常用的两类固定化技术。交联酶晶体一般分两步进行，首先是将一定浓度的蛋白质溶液结晶，然后采用双功能试剂如戊二醛将酶进行交联，在固定化过程中结晶是获得交联酶晶体的关键。交联酶晶体非常稳定，青霉素酰化酶的交联酶晶体在进行1000批反应后仍然保留了70%的初始活性［21］。由于获得青霉素酰化酶的晶体难度较大，所以交联酶晶体的应用受到一定的限制。Cao等［22］分别采用硫酸铵、叔丁醇和PEG 8000做为沉淀剂，用戊二醛作为交联剂制备了青霉素酰化酶交联酶聚集体，发现用叔丁醇做为沉淀剂获得的交联酶聚集体活性最高。Mateo等［23］采用聚醛葡聚糖作为交联剂获得了高活性的交联酶聚集体。交联酶晶体和交联酶聚集体在有机介质中表现出良好的活性，在非水相酶催化中具有良好的应用前景，Sheldon在这方面做了详细综述［24］。

    3  青霉素酰化酶催化生产6?APA

    6?APA是β?内酰胺抗生素工业中的重要中间体，经过结构修饰可以获得阿莫西林、氨苄西林等重要的抗生素药物。1970年，Gist?Brocades(后为DSM的子公司)开始化学法生产6?APA，称为“Delft裂解”，这种化学工艺延续了10～20年，由于使用了大量的有毒害试剂，而且需要-40℃的低温，耗能严重，已经被淘汰。目前，工业生产6?APA都已采用酶法裂解工艺，年产量已经达到20000吨以上［25］。由于6?APA在β?内酰胺抗生素工业中的重要作用及其巨大的市场，青霉素酰化酶生产6?APA的新工艺和新技术不断涌现。

    3.1  两相系统中裂解青霉素的研究

    (1)水?有机相系统  青霉素在发酵结束后，需要在有机溶剂体系中且较低pH2.0～5.5的条件下进行萃取后成盐，通过结晶获得青霉素的钾盐或者钠盐，再进行溶解后进行酶法裂解。由于这个过程需要进行成盐结晶等复杂的操作，所以研究热点集中于青霉素萃取后在低的pH下直接在两相系统中进行酶法裂解，大大简化了操作工艺流程。两相系统中青霉素G、6?APA和苯乙酸都会在两相中进行分配，苯乙酸在有机溶剂中的分配系数受pH影响很大，所以青霉素的水解平衡依赖于pH。在低的pH下，苯乙酸很容易被萃取到有机相中，6?APA也可以得到结晶，导致产物的浓度不断降低，使反应向水解的方向进行，这样可以获得高的转化率。在正丁醇?水双相系统中进行青霉素G的酶水解，通过多级逆流萃取可以获得较高收率［26］，在50mmol/L青霉素G的底物浓度，起始pH为2.9的条件下，6?APA收率可达94%［27］。pH较低时水解青霉素G将导致青霉素G和产物6?APA的降解；较高的pH则有利于青霉素G和6?APA的稳定，pH从3.5提高到5.5，6?APA的降解常数从8.4×10-3/h降低到3.6×10-3/h，半衰期从也从82h提高到192h。同时，青霉素酰化酶在pH8.0附近时具有较高的活性，较低的pH并不利于发挥酶的最大催化效率。另外在双相系统中萃取青霉素G的有机溶剂如正丁醇或甲基异丁基甲酮(MIBK)可导致酶的变性，在正丁醇饱和的水溶液下青霉素酰化酶悬浮32d活力下降了58%［28］。针对青霉素酰化酶的不稳定问题，采用反相胶团体系，将青霉素酰化酶包埋在AOT/异辛烷反胶团中，活力与水相相比有提高，水解6h后的转化率可达70%以上［29］。采用亲水化共价交联技术将固定化青霉素酰化酶进行处理，在酶的周围制造一个亲水的微环境［30］，这样固定化青霉素酰化酶在有机溶剂中的稳定性大大提高，选择甲基异丁基甲酮作为两相系统中的有机相，在32℃、pH8.0的条件下悬浮400h，活力仅损失15%，6?APA收率也可达到96%［31］。可以预言，两相系统的发展将会大大简化青霉素酰化酶水解青霉素G的传统工艺，使酶法生产6?APA的成本大大降低。

    (2)浊点系统  非离子表面活性剂溶液与离子型表面活性剂溶液性质不同，在达到一定的温度或者有添加物存在的条件下，溶液会自动分相形成表面活性剂浓度很小的稀相(dilute phase)和富含表面活性剂的凝聚层相(surfactant?rich phase)，这个系统称为浊点系统(cloud point system)［32］。采用表面活性剂Tergitol TMN?3形成浊点系统，在控制适当的pH3.0～6.0的条件下可以实现将青霉素和6?APA分配于稀相，苯乙酸可以直接提取到凝聚层相，缓解产物的抑制作用，提高6?APA的收率。同时，随着表面活性剂量的增加，6?APA可以达到91%的收率［33］。Wang等［34］用摇瓶模拟了离散逆流反应器中青霉素酰化酶水解青霉素的实验，青霉素水解和苯乙酸提取可以同时进行。逆流作用形成pH梯度有利于青霉素水解过程的进行，但由于青霉素水解的最佳pH相对较高，产物萃取的最佳pH相对较低，所以要获得一个具有较高产物浓度，又有较高收率的反应是比较困难的。在浊点系统中，影响反应的主要因素有初始pH、底物浓度、表面活性剂与水溶液的比例以及固定化酶用量等。平衡pH受初始pH影响较大，对水?有机相两相系统来说，浊点系统中容易保持相对较高的pH，水相中产物6?APA的浓度较高［35］，同时青霉素酰化酶在较高的pH条件下也具有较高的稳定性［36］。浊点系统作为新型反应体系，具有使用的非离子表面活性剂是绿色溶剂，极性范围较高，对于中度极性的产物或底物容易进行分离，容易回收利用，商品化非离子表面活性剂较多且价格相对较低［37］，故浊点系统在青霉素水解中具有一定的工业应用前景［38］。

    (3)双水相体系  双水相体系是指某些高聚物之间或者高聚物与无机盐之间在水中以适当浓度溶解后形成的互补相溶的两相或者多相体系。双水相体系已经被广泛应用于生物大分子物质的分离纯化，由于双水相体系具有界面张力小，传质阻力小，能够快速达到分离平衡，成相的高聚物通常采用PEG，PEG对于酶等生物活性物质不存在破坏作用，利用底物、产物的相分配系数不同来消除产物抑制，提高收率等优点，已经在生物催化领域得到重视，在生物分离领域具有广泛的应用前景。1984年，Andersson等［39］最早将双水相体系应用于青霉素的酶法水解，在8.9% PEG 20000和7.6%磷酸钾两相系统中研究了青霉素酰化酶水解青霉素，并对酶进行了多次回收使用。利用PEG20000和Dextran T70构成的双水相系统，37℃条件下，6?APA收率高于90%，由于6?APA可直接从上相进行结晶，简化了后期分离纯化工艺，最终得到96%纯度的6?APA［40］。采用全细胞青霉素酰化酶催化水解青霉素G可以在PEG6000和磷酸钾构成的双水相体系中进行，细胞和底物分配在下相，产物都分配在上相，酶无需纯化，产物对酶活的抑制作用降低，有效降低生产成本。转化10批次以上细胞的青霉素酰化酶酶活力才开始降低［41］，全细胞催化制备催化剂比较简单，但缺点是催化剂的寿命较短，不能长期使用。最近，金科铭等［42，43］研究了在两种高聚物(PADB对pH敏感，PNBC对光敏感)中青霉素G的水解，虽然6?APA的收率仅为85%左右，但是由于成相聚合物在反应后通过光照和pH变化进行回收，回收率达到了95%～98%，这样降低了成本，使双水相系统在生产6?APA工艺中极具竞争力。

    3.2  离子液体系统中裂解青霉素的研究

    离子液体是指在室温或者接近室温时完全由离子组成的液体物质［44］。离子液体由于没有蒸气压，所以不挥发，具有较好的热稳定性。一般由有机阳离子和无机阴离子构成，改变阴阳离子的组成，可以合成不同性质的离子液体。作为一种绿色溶剂，离子液体最近受到广泛关注，已经作为反应介质应用于生物转化［44～46］。离子液体作为介质的生物催化主要以脂肪酶为模型来催化转酯、酯化、水解和氨解等反应［47～49］。近来在制备6?APA也有应用，采用长链咪唑类离子液体［C14mim］Cl(1?十四烷基?3?甲基咪唑氯盐)形成反胶团溶液，进行青霉素G酶法水解的研究，发现在不加底物的情况下，在pH7.0时，离子液体对青霉素酰化酶的溶解性是CTAB阳离子表面活性剂构成的反胶团溶液的2.3倍，酶活力和稳定性也比在CTAB胶团溶液高［50］。Zhang等［51］制备了六氟化磷盐［bmim］PF6、1?丁基?3?甲基咪唑的四氟化硼盐［bmin］BF4、二氰氨基合1一甲基一3一丁基咪唑［bmim］dca、［omim］BF4四种离子液体，在这四种离子液体与水形成的两相溶液中进行青霉素G的水解，发现在［bmim］PF6中酶具有较高的稳定性且具有较高的转化率。Basso等［52］在控制水活度的条件下，研究了青霉素酰化酶在由两种阳离子［omim］、［bmim］和三种阴离子BF4-、PF6-、CH3OSO3-构成六种不同的离子液体中的稳定性， 发现青霉素酰化酶在［omim］PF6-中有较好的稳定性，而且酶的稳定性受阴离子的影响较大。

    3.3  反应器及其它技术

    选择合适的反应器，对提高6?APA的产量和质量非常重要。固定化青霉素酰化酶反应器通常有搅拌釜式、柱式填充床、中空纤维膜、电渗析耦合反应器等，各自特点和优缺点在龚俊波等的综述［53］中已经详细叙述，在此不再赘述。本文就青霉素酰化酶反应器中采用的相关技术做一简单介绍。在电渗析耦合反应器中，通过电渗析将产物苯乙酸和6?APA同反应溶液分离，降低产物抑制作用，使得水解反应速率提高了近两倍，青霉素G的转化率从94.8%提高到96.1%［54］。膜分离也是酶法生产6?APA的主要技术之一，采用耦联超滤膜反应器进行青霉素G的酶法水解是可行的［55］，但是耦合膜反应器或者仅仅采用膜反应器的效果并不理想，特别是在高浓度底物的条件下，转化率较低，膜的成本也较高，所以出现了电膜反应器或者将膜反应器与电渗析相耦联的技术。Pribyl等［56］采用离子交换膜设计了电膜反应器，发现在优化条件下相对产率可以提高80%［57］，该反应器可以用于青霉素G的连续水解中［58］。

    产量超过85%的6?APA主要是采用青霉素G酰化酶水解青霉素G得到的。但Shewale［59］指出，如果采用青霉素V酰化酶水解青霉素V来获得6?APA，则具有更大的优势，因为青霉素V在低pH条件下比青霉素G更稳定，能够避免青霉素V在较低pH条件下从发酵液中提取时所产生的降解；而且青霉素V酰化酶比青霉素G酰化酶具有更广泛的pH适应性和更高的稳定性，在水解反应中还可以得到更高的收率。

    4  结语

    由于青霉素类抗生素药物在临床上的广泛应用，青霉素酰化酶在医药中的重要作用将越来越大。因此，对反应器和反应介质的优化和创新的研究将会推动6?APA的生产。筛选性能更优越的青霉素酰化酶产生菌株，进行发酵工艺优化获得高产也是其中的一个方向［60～62］。随着酶生产技术的发展，获得的青霉素酰化酶稳定性的不断提高，两相系统势必会在工业中得到应用，将导致6?APA的生产成本大大降低。由于6?APA的巨大产量，生产工艺中技术的任何革新都将给生产带来巨大的效益。我国是6?APA的生产大国，在生产6?APA的工艺和青霉素酰化酶上迫切需要加强研究并转化为生产力，这将有利于我国社会经济的发展。

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