甲氧西林耐药溶血葡萄球菌大环内酯类和林可酰胺类耐药基因型与表型分析

        作者：吴伟元 潘小梅 卢月梅 吴劲松 程锦娥 甘志彪 李红林 陆坚

【摘要】  目的 研究甲氧西林耐药溶血葡萄球菌(MRSH)大环内酯类和林可酰胺类的耐药机制。方法 琼脂稀释法测定3种抗菌药对63株溶血葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)，PCR技术检测mecA、ermA、ermB、ermC、msrA/msrB和linA/linA′耐药基因。结果 62株MRSH均携带mecA，最常见大环内酯类和林可酰胺类耐药基因为msrA/msrB(59.7%)，其次linA/linA′(50%)和ermC(32.3%)，50%菌株携带2种耐药基因，3.2%菌株携带3种耐药基因；21株携带erm均对红霉素高耐(MIC≥256μg/ml)，对克林霉素结构型MLSB或诱导型MLSB耐药；14株携带msrA/msrB对红霉素中度耐药(MIC=32或64μg/ml)；31株携带linA/linA′，3株对克林霉素耐药，其余均对克林霉素敏感。结论 MRSH携带msrA/msrB、linA/linA′和ermC基因是其对大环内酯类和林可酰胺类产生耐药的主要原因。

【关键词】  溶血葡萄球菌； 大环内酯类； 林可酰胺类； 耐药基因

    ABSTRACT  Objective  To investigate the prevalence of resistance mechanisms against macrolides and lincosamides in methicillin?resistant S.haemolyticus (MRSH).  Methods  Agar dilution method was performed to detect the minimal inhibition concentration (MIC) of 3 antimicrobial agents against 63 strains of S.haemolyticus, and the resistance genes of mecA, ermA, ermB, ermC, msrA/msrB and linA/linA′ were anzlyzed by PCR in all clinical isolates.  Result  Among the 62 isolates of MRSH estimated by harboring the mecA gene, high occurrence of macrolides and lincosamides resistance genes msrA/msrB (59.7%), linA/linA′ (50%), and ermC (32.3%) were found; 50% of MRSH were detected harboring two different resistance genes, and 3.2% were detected harboring three; 21 strains with erm gene demonstrated high resistance to erythromycin (MIC≥256 μg/ml), and constitutive MLSB or inducible MLSB resistance to clindamycin; 14 isolates with msrA/msrB gene showed moderate resistance to erythromycin (MIC=32 or 64 μg/ml); 31 strains with linA/linA′ gene were all susceptible to clindamycin, with the except of three ones.  Conclusion  Resistance to macrolides and lincosamides in MRSH was mainly due to the presence of msrA/msrB, linA/linA′ and ermC genes.

    KEY WORDS  Staphylococcus haemolyticus;  Macrolides;  Lincosamides;  Resistance gene

    大环内酯类和林可酰胺类是临床上葡萄球菌感染常用的抗菌药。溶血葡萄球菌可通过ermA、ermB和ermC基因介导对大环内酯类、林可酰胺类和链阳菌素B耐药(MLSB耐药)，包括结构型和诱导型。该菌可通过主动外排(msrA或msrB基因介导)对大环内酯类和链阳菌素B耐药(MS耐药)，或利用林可霉素核苷转移酶(linA/linA′基因介导)灭活林可霉素和克林霉素(体外仅对林可霉素高耐，对克林霉素表现敏感)，给临床抗感染治疗造成极大困难［1］。本研究调查深圳市人民新生儿分离溶血葡萄球菌对红霉素和克林霉素的耐药特点及基因型，为临床防治该菌感染提供基础。

    1  材料和方法

    1.1  菌株来源

    2002年1月～2005年12月深圳市人民医院新生儿科分离的63株溶血葡萄球菌(排除同一病人同一部位重复分离的菌株)，其中来源于血液39株、气管分泌物17株、咽拭子3株、伤口分泌物2株、脑脊液和深静脉导管各1株。菌种鉴定采用VITEK系统(Bio?Merieux，法国)及常规生化试验。标准株金葡菌B158(mecA+)由北京大学临床药理研究所惠赠。

    1.2  抗菌药、药敏纸片、培养基和生化试剂

    抗菌药有苯唑西林［中诺药业(石家庄)有限公司］、红霉素(大连美罗大药厂)、克林霉素(山东方明药业股份有限公司)。药敏纸片红霉素(15μg/片)和克林霉素(2μg/片)及Mueller?Hinton琼脂(MHA)培养基均为英国OXOID公司产品。TaKaRa TaqTM(5U/μl)、10×Taq酶缓冲液、dNTPs(2.5mmol/L)、DNA Marker DL2000均购自大连宝生物有限公司，琼脂糖购自BIOWEST公司，溴化乙啶购自Bio?Rad公司。

    1.3  方法

    (1)药敏试验  使用琼脂稀释法检测3种抗菌药对63株溶血葡萄球菌的MIC，检测苯唑西林抗菌活性使用含2% NaCl的MHA，含苯唑西林药敏平板接种后35℃孵育24h，其它药敏平板孵育16～20h，金葡菌ATCC29213作为质控菌，按临床实验室标准委员会(CLSI)2006年标准判断结果。采用D试验检测大环内酯类诱导型MLSB耐药，按Kirby?Bauer纸片琼脂扩散法测定红霉素和克林霉素的抑菌环直径，纸片中心间距21mm，以克林霉素抑菌环靠近红霉素纸片一侧因拮抗作用出现缺损的边界判定D试验阳性，金葡菌ATCC25923作为质控菌。

    (2)耐药基因的PCR扩增

    引物设计与合成  见表1。根据实验设计进行适当修改，引物全部由英骏生物公司合成。

    模板的制备  将受试菌接种于MH平皿过夜培养，挑取数个菌落于100μl重蒸水中制成菌悬液，加入60μl矿物油，95℃煮沸5min，室温冷却，于4℃、14000r/min离心10min，取上清液为模板。使用GeneAmp PCR System 9700(美国ABI公司)进行PCR扩增。

    PCR反应体系  50mmol/L KCl，10mmol/L Tris?HCl(pH9.0)，0.1mmol/L四种dNTPs(ATP，CTP，GTP，TTP)，0.2μmol/L各引物，2.0mmol/L MgCl2，2 U Taq DNA聚和酶，5μl模板，反应总体积为50μl。

    PCR循环条件  报道［1～3］，并结合本实验进行调整。

    16S rRNA基因作为mecA基因扩增的内部质控。表1        PCR扩增使用的引物 *：本研究使用菌株。    shl：溶血葡萄球菌。    (3)耐药基因的测序和序列分析  将质控菌耐药基因的PCR产物送英骏公司用UltraClean PCRClean?up Kit(MIBIO公司)纯化，用The ABI PRISM   3730 DNA Sequencer测序。使用DANMAN6.0软件，将扩增产物的DNA序列与GenBank中的已知序列对比分析，证实扩增产物为目标基因片段。

    2  结果

    2.1  受试菌的药物敏感性

    琼脂稀释法检测63株溶血葡萄球菌体外药物敏感性，62株耐苯唑西林(MIC≥0.5μg/ml)，1株对苯唑西林敏感(MSSH)，同时对红霉素和克林霉素敏感；49株(77.8%)对红霉素耐药(MIC≥8μg/ml)，8株(12.7%)对克林霉素耐药(MIC≥4μg/ml)。D试验检测克林霉素诱导型MLSB耐药，共15株阳性。

    2.2  溶血葡萄球菌mecA基因与苯唑西林敏感性

    62株分离菌PCR检测mecA基因阳性，证实为MRSH(与稀释法结果完成一致)，其中10株对苯唑西林低耐(MIC为1或2μg/ml)，37株表现高耐(MIC≥128μg/ml)，如表2所示。2.3  MRSH大环内酯类耐药基因型与表型分析

    PCR检测62株MRSH的ermA、ermB、ermC、msrA/msrB和linA/linA′基因(图1、图2和图3)。21株erm扩增阳性，其中20株(32.3%)ermC阳性，1株ermB阳性，未发现ermA阳性株；37株(59.7%)扩增msrA/msrB阳性，31株(50%)扩增linA/linA′阳性。分别有21株(33.9%)、31株(50%)和2株(3.2%)携带1种、2种和3种不同耐药基因。如表3所示，8株未检出大环内酯类耐药基因的分离菌均对红霉素敏感，表2        63株溶血葡萄球菌mecA基因与苯唑西林MIC分布特点 表3   62株MRSH大环内酯类和林可酰胺类耐药基因型与表型分析 *：D试验阳性的菌株数。  E：红霉素耐药；  C：克林霉素耐药；  i：诱导型耐药。

    其中7株对克林霉素敏感，1株低耐(MIC=8μg/ml)；20株ermC阳性菌均对红霉素高耐(MIC≥256μg/ml)，5株对克林霉素结构型MLSB高耐(MIC≥128μg/ml)，15株为诱导型MLSB耐药(MIC为0.125或0.25μg/ml)；1株ermB阳性分离菌(同时携带msrA/msrB和linA/linA′基因)对红霉素和克林霉素高耐；6株仅携带msrA/msrB，8株携带msrA/msrB及linA/linA′的菌株，对红霉素中度耐药(MIC=32或64μg/ml)，但均对克林霉素敏感；31株linA/linA′阳性菌中，1株对克林霉素低耐(MIC=8μg/ml)，2株对克林霉素高耐(MIC≥128μg/ml，同时携带ermC或ermB基因)，其余菌株均对克林霉素敏感。1株MSSH经PCR证实不含ermA、ermB、ermC、msrA/msrB和linA/linA′基因。

    3  讨论

    erm、msr和lin(也称lnu)基因是导致葡萄球菌对大环内酯类和林可酰胺类耐药最主要的原因。不同菌种其耐药基因型存在明显的差异［1，3，4］。金葡菌以ermA基因最常见(尤其MRSA)，主要介导结构型MLSB耐药；其次ermC(多见于MSSA)，多介导诱导型MLSB耐药；ermB、msrA/msrB和linA/linA′基因均较少见。凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)以ermC多见，其次为ermA，两者均介导结构型和/或诱导型MLSB耐药，ermB则少见。Lina等［1］检测150株CNS的大环内酯类和林可酰胺类耐药基因，发现最常见的是erm和msrA基因，且多以单基因形式出现，如ermC单独出现占44.0%，包括21株MSCNS和45株MRCNS，其中结构型和诱导型MLSB耐药分别占23.3%和20.7%；ermA单独出现占18.0%，包括2株MSCNS(甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌)和25株MRCNS(甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌)，其中结构型和诱导型MLSB耐药分别占11.3%和6.6%；仅2株携带ermB基因；msrA单独出现占11.3%，包括6株MSCNS和11株MRCNS(10株为MRSH)，少数菌株同时携带2种或2种以上基因，仅6株携带linA/linA′基因。Martineau等［3］检测188株表皮葡萄球菌erm和msrA基因，结果124株携带ermC，9株携带ermA，8株携带msrA，仅1株携带ermB；Novotna等［5］检测98株MRCNS的erm、msrA和linA/linA′基因，53%菌株携带msrA，42.9%菌株携带erm，30%菌株携带linA/linA′，33%菌株携带2种耐药基因，4%菌株携带3种耐药基因；其中62株为MRSH，最常见耐药基因为msrA(69%)，其次linA/linA′(29%)和erm(27%)，27株为MRSE(甲氧西林耐药表葡菌)，最常见为erm(59%)，其次msrA(26%)和linA/linA′(11%)；另发现10株MRSH未携带上述3种耐药基因，对红霉素敏感，但对林可霉素和克林霉素耐药，最近发现它们均携带一种新的vga(A)突变基因vga(A)LC，4个关键位点氨基酸的替代扩大了vga(A)LC的底物谱，除主动外排链阳菌素A外，也可主动外排林可霉素和克林霉素，导致耐药产生［6］。

    本研究62株MRSH的耐药基因型与Novotna等报道接近，最常见为msrA/msrB(59.7%)，其次linA/linA′(50%)和ermC(32.3%)，50%菌株携带2种耐药基因，3.2%菌株携带3种耐药基因。携带erm菌株均对红霉素高耐，携带msr菌株对红霉素可表现中度耐药。2株MRSH对克林霉素低耐(MIC=8μg/ml)，对红霉素均敏感，其中1株仅携带linA/linA′，另1株未检出erm、msr和linA/linA′基因，这2株菌是否携带vga(A)LC或其它未知耐药基因，尚需进一步研究。

【参考文献】
  ［1］ Lina G, Quaglia A, Reverdy M E, et al. Distribution of genes encoding resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramins among Staphylococci ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1999,43(5):1062～1066.

［2］ Oliveira D C, Lencastre H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin?resistant Staphylococcus aureus ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2002,46(7):2155～2161.

［3］ Martineau F, Picard F J, Lansac N, et al. Correlation between the resistance genotype determined by multiple PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2000,44(2):231～238.

［4］ Fluit A D C, Visser M R, Schmitz F J. Molecular detection of antimicrobial resistance ［J］. Clin Microbiol Rev,2001,14(4):836～871.

［5］ Novotna G, Adamkova V, Janata J, et al. Prevalence of resistance mechanisms against macrolides and lincosamides in methicillin?resistant coagulase?negative Staphylococci in the Czech Republic and occurrence of an undefined mechanism of resistance to lincosamides ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2005,49(8):3586～3589.

［6］ Novotna G, Janata J. A new evolutionary variant of the streptogramin A resistance protein, vga(A)LC, from Staphylococcus haemolyticus with shifted substate specificity towards lincosamides ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2006,50(12):4070～4076.