鲍曼不动杆菌ADC型AmpC β?内酰胺酶基因研究

              作者：黄支密 储秋菊 糜祖煌 单浩 杨海燕 仵蕾 秦玲

【摘要】  目的 了解浙江湖州解放军第98自临床分离的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)中ADC型AmpC β?内酰胺酶基因(blaADC)存在状况。方法 收集2000年7月～2002年12月所分离到的60株鲍曼不动杆菌，采用聚合酶链反应及序列分析的方法分析blaADC基因。结果 60株中有59株blaADC基因呈阳性(98.3%)，序列分析表明4号菌株(原始编号HZB3944)blaADC基因为一新亚型，其核酸序列已登录GenBank(注册号EF569589)。结论 鲍曼不动杆菌中blaADC基因阳性率很高，产ADC型AmpCβ?内酰胺酶是本组菌株对β?内酰胺类抗生素耐药的重要原因之一。

【关键词】  鲍曼不动杆菌； ADC型； AmpC β?内酰胺酶

    ABSTRACT  Objective  To investigate the ADC type AmpC beta?lactamase gene (blaADC) in Acinetobacter baumannii isolated from the 98th Hospital of PLA, Huzhou District, Zhejiang province, China.  Methods Sixty strains of Acinetobacter baumannii were isolated from hospitalized patients between July, 2000 and Dec. 2002. The blaADC gene were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) and verificated by DNA sequencing. Results  The positive rate of blaADC gene was 98.3% (59/60). The blaADC gene in No.4 strain (its original serial number was HZB3944) was sequenced and determined to be a novel subtype (GenBank ACCESSION: EF569589).  Conclusion  There was very high positive percentages of blaADC gene in Acinetobacter baumannii, and producing ADC type AmpC beta?lactamase was the important cause of resistant to β?lactams antibiotic.

    KEY WORDS  Acinetobacter baumannii;  ADC type;  AmpC beta?lactamase

     鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，AB)对β?内酰胺类抗生素的耐药性与耐药机制以及多重耐药(泛耐药、全耐药)菌株感染的临床仍是当前关注的热点［1～10］。我们曾报道了60株鲍曼不动杆菌8种(群)β?内酰胺酶(β?lactamases，BLA)基因型研究情况［11］。为进一步明确该60株菌对β?内酰胺类抗生素耐药机制，我们采用分子生物学技术又分析了包括ADC型AmpC β?内酰胺酶基因(blaADC)等3种β?内酰胺酶基因，并采用三维试验法检测β?内酰胺酶。报道如下。

　　1  材料与方法

    1.1  菌株来源、鉴定及耐药情况

    60株菌全部分离自解放军98医院2000年7月～2002年12月住院患者临床标本，其中痰液33份，创伤伤口分泌物13份，烧伤创面分泌物10份，气管切开口分泌物2份，中段尿和血液各1份，并经法国Bio?Merieux公司API 20 NE重新鉴定。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603和铜绿假单胞菌ATCC27853。采用法国Bio?Merieux公司ATB药敏试验条板微量肉汤法测定20种抗菌药物的敏感性，分别为阿莫西林(AMPC)、阿莫西林/克拉维酸(AMPC/CA)、哌拉西林(PIPC)、哌拉西林/三唑巴坦(PIPC/TB)、替卡西林(TIPC)、替卡西林/克拉维酸(TIPC/CA)、头孢噻吩(CET)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(CPE)、氨曲南(AZ)、亚胺培南(IMP)、美罗培南(MRP)、妥布霉素(TOB)、阿米卡星(AMK)、庆大霉素(GM)、奈替霉素(NTL)、复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)、环丙沙星(CPLX)、多黏菌素(COL)。60株鲍曼不动杆菌对COL全部敏感；对碳青霉烯类抗生素IMP、MRP的敏感率高达98.3%；对第三、四代头孢菌素的耐药率达58.3%～80%；对CPLX耐药率达80%，对SMZ/TMP及4种氨基糖苷类抗生素的耐药率达86.7%［11］。

    1.2  ESBLs和AmpC酶检测

    采用三维试验法，底物为CTX，委托浙江大学医学院附属第一医院传染科完成［12］。

    1.3  基因检测

    全部采用PCR法。采用蛋白酶K消化法制备DNA扩增模板，共检测11种(群)BLA基因，其中本次检测的3种基因blaADC、blaGES和blaCARB的引物序列及产物长度见表1，先前已检测的8种基因blaTEM、blaSHV、blaOXA?10群、blaCTX?M?1群、blaCTX?M?2群、blaCTX?M?9群、blaPER?1和blaVEB的引物序列及产物长度见［11］。由于59号菌株同时对IMP和MRP耐药，因此还进行了blaIMP、blaOXA?23群及blaOXA?24群基因PCR检测，引物序列及产物长度见表1。根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已发布的各型基因序列设计引物。耐药基因检测试剂盒、阳性对照及DNA Marker均由无锡市克隆遗传技术研究所提供。纯水为阴性对照。按说明设置各型扩增参数，于PE9600基因扩增仪扩增。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性，并拍照保存。

    1.4  序列测定及分析

    部分扩增阳性基因PCR产物经纯化后用ABI自动DNA序列分析仪进行序列测定，所测序列采用GenBank中的BLAST程序进行同源性分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)。blaADC全长基因序列分2段扩增与测序。A段引物为：5′?ATGCGATTTAAAAAAATTTCTTGTC/TTA?3′，5′?CTAAGA(C/G)TTGGTC(G/A)AA(A/G)GGT?3′；B段引物为：5′?CTAAGA(C/G)TTGGTC(G/A)AA(A/G)GGT?3′，5′?TTATTTCTTTATTGCATTCAGCA?CAA/GC?3′。

    2  结果

    2.1  三维试验结果

    60株菌BLA均阳性，其中18株(30.0%)单独产ESBLs，29株(48.3%)同时产ESBLs和AmpC两种酶，1株(1.7%)单独产AmpC酶；10株(16.7%)所产BLA不水解CTX；其余2株(3.3%)能水解CTX，但当克拉维酸和氯唑西林同时加入时抑酶试验仍为阴性，且不水解IMP，可能为耐抑制剂的BLA(非碳青霉烯酶)。合计47株(78.3%)产ESBLs，30株(50.0%)产AmpC酶［12］。

    2.2  基因检测结果

    共检出3种基因(blaTEM、blaSHV和blaADC)，阳性株数(%)分别为60株(100.0%)、18株(30.0%)［11］和59株(98.3%)，其余8种(群)基因均阴性(59号菌株blaIMP、blaOXA?23群及blaOXA?24群基因也阴性)。4号(原始编号HZB3944)菌株blaADC基因PCR产物电泳见图1。

    2.3  序列分析结果

    鲍曼不动杆菌4号菌株blaADC基因共测得1152个核苷酸，经BLAST程序同源性分析，不同于已发布的序列，为一新亚型，其核酸序列已登录GenBank，注表1        靶基因PCR引物序列及产物长度册号EF569589。该核苷酸序列与美国核酸数据库中已登录的blaADC基因DNA序列分子进化分析显示，4号菌株blaADC基因DNA序列为独立的一个分支，可确认为新亚型。从60株blaTEM基因阳性中任选8株以及全部18株blaSHV基因阳性PCR产物测序结果见文献［11］。

    2.4  60株鲍曼不动杆菌抗菌药物表型及BLA基因型检测

    结果见表2、表3。

    3  讨论

    鲍曼不动杆菌系条件致病菌，普遍存在于环境中，耐受肥皂，是医务人员手上最常分离的革兰阴性表2        60株鲍曼不动杆菌对20种抗菌药物的表型 表3        60株鲍曼不动杆菌的β?内酰胺酶基因型检测结果及blaOXA?24群基因也阴性)，结果均未列入表中；

    任选8株(8、9、10、15、20、30、32和35号株)blaTEM基因阳性PCR产物测序，结果均为blaTEM?1型，其中35号(原始编号：HZ40)菌株blaTEM?1

    序列已在GenBank登录(GenBank登录号：AY263331)；

    18株blaSHV基因阳性经测序，1号(原始编号：HZ01)菌株为新亚型，已在GenBank登录被命名为blaSHV?48(GenBank登录号：AY259164)，

    其余17株均为blaSHV?12型ESBLs，其中2号(原始编号：HZ02)菌株blaSHV?12序列也在GenBank登录(GenBank登录号：AY259163)［11］；

    4号菌株blaADC基因为新亚型，其核酸序列已登录GenBank，注册号为EF569589。      M：分子量标记，由上而下分别为1000、900、800、700、

    600、500、400、300、250、200、150、100、50bp；

    P：阳性对照；  N：阴性对照；  S：标本阳性

    图1    鲍曼不动杆菌4号菌株blaADC基因PCR产物电泳图

    菌［13］。鲍曼不动杆菌除引起创伤伤口和烧伤创面感染、菌血症、脑膜炎、泌尿系统感染外，还可在住院患者中，尤其是重症监护病房(ICU)内引起医院获得性肺炎，成为严重的医院感染病原菌。临床分离的菌株常呈多重耐药，甚至泛耐药、全耐药株也日益增多。由泛耐药株引起的感染常常无药可治，病死率高。

    细菌对β?内酰胺类抗生素耐药主要是产生BLA，作用机制为水解β?内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性，其水解效率是细菌耐药性的主要决定因子。近年来，鲍曼不动杆菌对β?内酰胺类药物的耐药机制主要集中在苯唑西林水解酶、金属酶、AmpC酶和ESBLs，此外还有抗生素渗透障碍如外膜蛋白改变［14］、青霉素结合蛋白(PBPs)的改变［15］等耐药机制。

    已在鲍曼不动杆菌中检测到的BLA基因型主要有blaTEM?1［11，16］、blaTEM?92［1］及blaTEM?116［16］型ESBL、blaSHV?12［11，16］、blaPER?1［17］、blaVEB?1［18］、blaCTX?M?2［19］、blaOXA型碳青霉烯酶(如blaOXA?20［20］、blaOXA?23?like、blaOXA?24?like、blaOXA?51?like、blaOXA?58?like［5］)、质粒介导的AmpC酶基因blaDHA［10］、获得性金属酶(碳青霉烯酶)基因如blaIMP［9］和blaVIM［21］、染色体介导的AmpC酶基因［22］等。2006年Roberts［23］报道了在所研究的多重耐药鲍曼不动杆菌AYE株的基因文库有52个与耐药性相关的基因，其中7个基因也存在于敏感株SDF，但是该多重耐药株具有额外的86kb的基因区域，含有多达45个耐药基因，被称为“耐药岛”(resistance island)，这是迄今在细菌所发现的最大耐药基因区域，该区域包括了24个对不同类别抗菌药物和16个对重金属盐或季胺类消毒剂的耐药基因等。

    质粒介导的blaTEM基因在鲍曼不动杆菌中普遍存在［1，5，10，11，16］。在本文的相关研究中，我们曾于2003年报道在国际上首次发现携带blaSHV?12型ESBL基因鲍曼不动杆菌［11］，证实了在世界范围内在肠杆菌科细菌(如肺炎克雷伯菌)中广泛流行的质粒介导的blaSHV?12型ESBL基因向肠杆菌科以外鲍曼不动杆菌转移。携带blaPER?1型ESBL基因鲍曼不动杆菌曾在土尔其流行［17］，在我国的上海、北京、河北石家庄［10］、浙江湖州［6］等地均有发现，但本组菌株中未发现，可能与菌株来源差异(如时间、地理位置不同)有关。

    2000年Bou等［22］首次报道不动杆菌耐药株产生了染色体AmpC酶，对AmpC酶基因克隆并测序了一个1152bp的开放读码框架(ORF)。这个ORF以TAA结尾，编码由383个氨基酸组成的蛋白。该酶含有一般AmpC酶激活位点的SXSK序列以及C类酶的典型序列YXN、KTG，与阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌的AmpC酶基因有一定的同源性。当增加诱导物头孢西丁时，未见AmpC酶量增多，因而是非诱导性的。该研究在ampC基因的侧翼区未发现ampR序列，说明鲍曼不动杆菌中是否存在ampR调节基因还有待于进一步研究。Ribera等［24］在对15株与流行无关的鲍曼不动杆菌研究中，用PCR检出了AmpC酶基因，并在体外使用AmpC酶抑制剂Syn2190后，耐头孢他啶的AmpC菌株的最低抑菌浓度(MIC)均降低，推断产生了AmpC酶，Segal等［25］从耐药鲍曼不动杆菌中也发现了AmpC酶，可见AmpC酶是鲍曼不动杆菌对β?内酰胺酶类抗生素耐药的原因之一。但对耐药不动杆菌产生的AmpC酶基因仍缺乏深入的分析，与其它细菌产生的AmpC酶也缺乏深层次的比较。

    产染色体介导的非诱导型高产AmpC酶在鲍曼不动杆菌的多重耐药以及对β?内酰胺类抗生素的交叉耐药中有重要意义［26］，因有别于其他AmpC酶，Hujer等［27］将其命名为ADC β?内酰胺酶(ADC为acinetobacter?derived cephalosporinases的缩写，是不动杆菌所产的头孢菌素酶)。截止2007年6月在美国国立生物信息中心(NCBI)已登录的亚型近30种(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)，尚未发现其它细菌携带blaADC基因［22，24，25］。潘晓龙等［28］在31株多重耐药鲍曼不动杆菌中发现有30株菌(96.0%)存在ampC基因(所用引物仅能扩增ampC基因部分片段)，可见阳性率极高，但略低于本文的98.3%；刘丁等［29］对46株鲍曼不动杆菌进行ampC基因扩增，结果有39株菌(84.8%)阳性，其中三维试验AmpC酶呈阳性的22株菌均扩增出ampC基因条带，其余三维试验AmpC酶呈阴性的24株菌中有17株扩增出ampC基因条带(所用引物为5′?TAAACACCACTATGTTCCG?3′和5′?ACTTACTTCAACTCGCGACG?3′)。本研究4号菌株blaADC阳性，经测序确认为新亚型，其酶学特性有待研究。

    研究表明，以染色体介导的非诱导型高产ADC型AmpC酶基因blaADC在鲍曼不动杆菌中普遍存在(阳性率很高或较高)［22，24～29］，但是仍未在不动杆菌属中其他的种内发现blaADC基因，也未在不动杆菌以外的细菌中发现此基因，提示检测blaADC基因不失为鉴定鲍曼不动杆菌特异性的、快速的依据。本组仅1株(27号株)blaADC基因阴性，原因有待探讨。

    尽管在鲍曼不动杆菌中blaADC基因阳性率很高(从84.8%［29］到100.0%［24］不等)，但三维试验结果表明AmpC酶阳性率低于blaADC基因阳性率［28，29］，如本文59株blaADC基因阳性菌中仅有30株(50.8%)AmpC酶阳性，存在表型与基因型不一致现象。提示影响blaADC基因表达因素较多，其详细机制有待深入研究。结果表明，携带blaADC基因并表达是本组菌株对β?内酰胺类抗生素耐药的重要原因之一。

    在鲍曼不动杆菌中检出质粒介导的AmpC酶基因报道较少，侯天文等［10］检出blaDHA基因阳性率为3.2%(1/31)，提示在鲍曼不动杆菌中产质粒介导的AmpC酶并不常见。由于本文未检测blaDHA等质粒介导的AmpC酶基因，因此不排除存在其它AmpC酶基因的可能性。

【】
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