HPLC?ELSD法测定β?内酰胺类抗生素注射剂中精氨酸的含量

【摘要】  目的 建立高效液相色谱?蒸发光散射检测法(HPLC?ELSD)分析β?内酰胺类抗生素注射用制剂中精氨酸的含量。 方法 采用Agilent Zorbax SB?C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相为0.1%三氟乙酸溶液∶乙腈(80∶20)，流速为0.8ml/min，漂移管温度为45℃，雾化气体压力为3.5bar。结果 供试品中精氨酸与抗生素主药及相关杂质分离良好，在10.27～314μg/ml的范围内呈较好的线性关系(r=0.99986)，在盐酸头孢吡肟中的平均回收率为101.5%，RSD为2.1%(n=9)；在氨曲南中的平均回收率为97.8%，RSD为1.8%(n=9)；在头孢拉定中的平均回收率为95.6%，RSD为1.9%(n=9)。以注射用盐酸头孢吡肟为例进行重复性试验，结果测得含精氨酸均值为37.0%，RSD为1.9%(n=9)，灵敏度试验测得方法的检测限和定量限分别为2和10μg/ml。结论 本法专属、快捷，结果准确，重现性好，可以作为部分β?内酰胺类抗生素注射用制剂中添加的活性物质精氨酸的含量测定方法。

【关键词】  β?内酰胺类抗生素； 精氨酸； 含量测定； 高效液相色谱法； 蒸发光散射检测器

    ABSTRACT  Objective  To develop an HPLC?ELSD method for determination of arginine in β?lactam antibilotic injection.  Methods  The column: Agilent Zorbax SB?C18 (4.6mm×250mm，5μm); the mobile phase∶0.1mol/L trifluoroacetic acid?methanol (80∶20); the drift tube temperature: 45℃; the pressure of nebulizing gas: 3.5bar.  Results  Good separation of arginine and main related substances could be achieved. The standard curve was rectilinear in the range of 10.27～314 μg/ml (r=0.99986). The average recovery in cefepime hydrochloride was 101.5% and RSD was 2.1% (n=9). The average recovery in aztreonam was 97.8% and RSD was 1.8% (n=9). The average recovery in cefradine was 95.6% and RSD was 1.9% (n=9). The limit of detection and quantification was 2μg/ml and 10μg/ml respectively.  Conclusion  The method is simple and rapid, the results are accurate and reproducible, and the method could be used for analysis of arginine in β?lactam antibilotic injection.

    KEY WORDS  β?Lactam antibilotic;  Arginine;  Determination;  HPLC;  ELSD

     目前已上市或申请上市的部分β?内酰胺类抗生素注射用制剂中常添加有碱性助溶剂(主要是碳酸钠或碳酸氢钠和精氨酸两大类)，以便临床应用中配制注射液时能够提高药物分子结构中酸性基团的解离程度，增强药物的水溶性。针对目前药典对含助溶剂的β?内酰胺类抗生素注射用制剂的质控现状及国外药典对同类抗生素注射用制剂的质控趋势，认为应建立对所含助溶剂含量进行准确测定的方法，以考察所含助溶剂对制剂中主药质量(比旋度、纯度和有关物质)和稳定性的影响。为进一步提高我国药典对该类抗生素制剂质量标准控制水平提供、全面的评价依据，本文选择以精氨酸为检测对象进行研究。

    由于精氨酸在紫外区缺乏特征性吸收，故部分含精氨酸的药物制剂其现行国家标准一般采用柱前衍生化法、或用强极性的二醇基柱(也有部分标准采用十八烷基硅烷键合硅胶柱加离子对试剂)以紫外末端吸收波长(通常为200～206nm)进行检测的HPLC法对其含量进行测定［1～9］。柱前衍生化HPLC法操作过程烦琐、影响因素较多，测定误差较大；另外二醇基柱为非常规色谱柱，实验室不够普及，限制了方法的实用价值；若采用极限末端吸收波长(210nm以下)为检测手段，易放大溶剂和共存物质的干扰性响应，引起意外的检测偏差。本文有关［10～13］，采用质量型蒸发光散射检测技术(ELSD)，建立准确、快速测定β?内酰胺类抗生素注射用制剂中精氨酸含量的HPLC?ELSD方法。

    1  仪器与试药

    Agilent1100组合式全自动高效液相色谱仪，Dikma SEDEX 75型ELSD检测器。

    水为重蒸水；三氟乙酸、乙腈均为色谱纯。精氨酸对照品2批(637?9903，872?200203)均由中国药品生物制品检定所提供。精氨酸工作对照品(S0501，99.5%)、盐酸头孢吡肟原料药1批(061101)及注射用盐酸头孢吡肟样品3批(070201、070202、070203)，注射用头孢拉定样品3批(060301、060302、060303)，氨曲南原料药1批(030501)及注射用氨曲南样品3批(030601、030602、030603)均由浙江海正药业股份有限公司提供。头孢拉定原料药1批(030601)由浙江浙邦制药有限公司提供。

    2  色谱条件

    色谱柱：Agilent Zorbax SB?C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温30℃；流动相为0.1%三氟乙酸溶液∶乙腈(80∶20)；流速0.8ml/min；ELSD漂移管温度45℃；雾化气体压力3.5bar；灵敏度(GAIN值)6；进样体积20μl。

   3  方法与结果

    3.1  系统适用性与专属性试验

    (1)与注射剂主药的分离  取精氨酸工作对照品3份，分别与盐酸头孢吡肟原料药、氨曲南原料药、头孢拉定原料药适量按处方比例混合，分别加水溶解并稀释制成每1ml中各含精氨酸约0.2mg的混合试验溶液，进样测试，结果发现在本法规定的色谱条件下，精氨酸峰与上述三种主药主色谱峰之间均能良好分离，分离度分别为6.8、6.9和23.9(图1～3)。试验结果表明，本法的流动相比例(80∶20)适应性较好，适用范围较宽，可以直接用于上述三种抗生素制剂中主药与精氨酸的分离检测，而不必一一调整。

    (2)强力破坏试验  取注射用盐酸头孢吡肟样品、注射用氨曲南和注射用头孢拉定样品各1批，分别称取样品5份(各约相当于含精氨酸20mg)，各置100ml容量瓶中，分别进行强光(暴露于254nm紫外光灯下24h)、强热(置120℃恒温干燥箱放置过夜)、加强氧化剂(加30%浓H2O2溶液5滴，室温下放置0.5h)、加强碱(滴加浓氨溶液5滴，室温下放置0.5h，滴加冰乙酸 精氨酸和主药头孢拉定的色谱分离适量使中和)及加强酸(加冰乙酸5滴，室温下放置0.5h，滴加浓氨溶液适量使中和)等5种极端条件的强力破坏，各加水溶解并稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，分别取样测试，记录色谱图至精氨酸峰保留时间的5倍，结果各破坏条件下供试品的降解产物峰均能与精氨酸主峰良好分离。附破坏程度最大的强氧化剂破坏各试验样品中精氨酸检测分离的典型色谱图(图4)。

    3.2  线性关系考察

    分别精密称取精氨酸对照品适量，加水溶解并分别定量稀释制成10.27、20.54、41.08、80.79、124.4、161.6、205.4、244.3和314.0μg/ml系列浓度的溶液，分别进样20μl，记录色谱图。以峰面积(A)的常用对数为纵坐标，测试浓度C(μg/ml)的常用对数为横坐标，以最小二乘法进行线性回归，得线性方程：

    logA=1.3626logC+8.5403  r=0.99986(n=9)

    结果表明，精氨酸在10.3～314μg/ml的范围内线性关系良好。线性关系图见图5。

    3.3  重复性试验

    同日取注射用盐酸头孢吡肟注射剂1批(批号070202)，分别精密称取适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含精氨酸0.2mg的溶液，即为重复性试验的供试品溶液(平行制备9份)，分别进样测试，按3.2项下的随行标准曲线法精氨酸的含量。结果测得注射剂中精氨酸的平均含量为37.0%(各测量值值分别为37.3%、37.2%、37.5%、37.4%、37.3%、36.6%、36.7%、37.8%和35.5%)，RSD为1.91%，表明本法的重复性好。

    3.4  准确性试验

    为考察注射剂中抗生素主药(在此视作辅料)对本法测定精氨酸含量准确性的影响，取盐酸头孢吡肟原料、氨曲南原料及头孢拉定原料各1批按各自注射剂规格处方制备模拟样品进行方法的加样回收率试验。

    分别以配方比例的80%、100%及120%精密称取精氨酸工作对照品适量，按注射剂规格(0.5g)投入常量的抗生素主药，加水溶解并定量稀释制成模拟的供试品溶液，依法进样测定；另取精氨酸对照品高、中、低3份，同法测定，按随行标准曲线法计算精氨酸在3种抗生素主药中的加样回收率。结果见表1～3。

    上述3种各3组加样试验结果表明，本法用于部分β?内酰胺类抗生素注射剂中精氨酸的含量测定具有较好的准确性。

    a：注射用盐酸头孢吡肟    精氨酸：3.046min；  头孢吡肟：3.925min；  其他为降解产物

    b：注射用氨曲南    精氨酸：3.048min；  氨曲南：3.983min；  其他为降解产物

    c：注射用头孢拉定    精氨酸：3.052min；  头孢拉定：3.933min；  其他为降解产物

    图4    加强氧化剂破坏试验的典型色谱图

    图5    方法的线性关系曲线图3.5  灵敏度试验

    取3.2项下线性关系考察的最低端浓度的对照品溶液，继续加水倍数稀释或逐级稀释至合适浓度区间，并一一进样测试，结果按信噪比(S/N)2∶1～5∶1计，测得本法的检测限为2μg/ml(S/N=1.9，2.5，4.0，2.9)；另取线性关系曲线的最低端浓度为定量限，即10μg/ml(图6)。    表1    在注射用盐酸头孢吡肟模拟样品中的回收率表2    在注射用氨曲南模拟样品中的回收率表3    在注射用头孢拉定模拟样品中的回收率

    3.6  样品测定

    精密称取注射用盐酸头孢吡肟样品适量，加水制成每1ml中约含精氨酸0.2mg的溶液，按本法规定的色谱条件进行含量测定。另取上述3批注射剂，按国家标准收载的经典离子对UV?HPLC法，采用十八烷基硅烷键合硅胶柱分析测定供试品中精氨酸的含量。结果见表4和图7、8。

    结果表明，上述两种方法测得的两组数据无明显差异。表4        两种方法测定注射用盐酸头孢吡肟中精氨酸含量的结果比较

　　4  讨论

    (1)溶解介质的选择  选择溶剂时分别考察了水和流动相。精氨酸易溶于水，用水为溶剂制备供试液比较方便，同时水又是流动相的主要成份，测定了水的空白图谱后，发现纯水不产生色谱峰，对检测无干扰。在用水和流动相分别制备溶液测定后，发现色谱峰的各项参数并无明显差异。故选择水作为溶剂。

    (2)流动相的选择  本研究选择以0.1%三氟乙酸?乙腈为流动相，试验了60∶40、70∶30、80∶20和90∶10四种流动相比例。试验发现，乙腈比例过高(如60∶40)时，精氨酸出峰过快，氨曲南与精氨酸不能基线分离，氨曲南峰形怪异；头孢吡肟虽峰形不差，但与精氨酸也不能基线分离，只有头孢拉定因分子极性较弱，色谱保留较强，能与精氨酸有合适的分离。比例调至90∶10时，精氨酸保留时间合适，氨曲南、头孢吡肟也均与精氨酸良好分离，但头孢拉定则久久不能洗脱，峰形严重展宽。经反复优化比较，选择以80∶20为本法规定的流动相比例，此时精氨酸保留时间合适，3种抗生素主药均能与精氨酸峰良好分离，且头孢拉定保留时间明显提前。

    (3)检测器漂移管温度的选择  本研究采用的蒸发光散射检测器为Dikma SEDEX 75，供应商推荐的漂移管温度为40℃。以该温度为基础，考察不同温度对检测的影响，设置的温度值为40℃、45℃和50℃。结果40℃时的色谱峰响应最大，0.2mg/ml浓度的精氨酸溶液进样20μl，其主峰面积约达3000±500，此时基线平稳、噪音合适，能满足精氨酸检测的需要。因此选择漂移管温度为45℃。

    (4)检测器雾化气体压力的选择  该型检测器推荐的载气压力为3.5bar，以此为基础，考察不同压力对检测的影响。设置的载气压力分别为2.5、3.5和4.0bar。结果载气压力为2.5bar时基线噪音变大，不利于检测；4.0bar时，基线最平稳，但色谱响应减小。综合考虑，将载气压力设为3.5bar。

    (5)检测器GAIN值的选择  该型检测器提供的GAIN值选择范围为1～12，供应商推荐的GAIN值为5～6。考察了GAIN值4～7时的分离情况，结果在上述四个GAIN值时各成分均能顺利分离。随着GAIN值的升高，基线噪音有所增加。比较GAIN值为4和7时的检测限，结果发现当S/N为3时两者检测限的差异不显著。根据本法检测精氨酸的实际需要，将GAIN值设定为6。

    (6)色谱柱和柱温的选择  本法色谱体系的pH值较低，往往超出一般ODS色谱柱的pH适用范围，故本文选择了对低pH耐受性能较好的Agilent Zorbax SB?C18为本法建议的固定相。

    在该色谱柱上，将柱温从20℃升高到40℃，色谱效能未见明显提升。柱温升高，保留时间相对缩短，柱效相对增加，但长时间运行有损色谱柱寿命。综合考虑，将柱温定为适中的30℃。

    (7)关于强力破坏试验  酸、碱破坏试验结果显示，当使用NaOH和或HCl进行破坏并分别相互中和形成NaCl，而Na+和Cl-在本色谱系统中均会出峰，保留时间接近精氨酸峰。为避免对精氨酸的测定构成干扰，本文采用浓氨溶液和冰乙酸代替进行试验。

    (8)HPLC?ELSD数据处理  根据蒸发光散射检测器的原理，样品浓度和检测器响应之间呈指数关系，对数转换后两者可呈线性，其线性方程的截距并不为零，因此在HPLC?ELSD系统中，不宜使用外标法含量。

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