青霉素酰化酶的固定化与应用新进展

                  作者：周成  王安明 王华  杜志强 祝社民 杨明 张俊 沈树宝

【摘要】  青霉素酰化酶被广泛应用于半合成抗生素及中间体的制备、手性药物的拆分和多肽合成等方面。高效固定青霉素酰化酶能提高酶对温度、pH值、溶剂极性等方面的适用性和反复使用的稳定性，将成为拓宽青霉素酰化酶在中应用的必然选择和关键。本文主要介绍了青霉素酰化酶固定化技术的进展，讨论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，并展望了固定化青霉素酰化酶的前景。

【关键词】  青霉素酰化酶； 载体； 固定化； 反应介质； 固定化酶的应用

    ABSTRACT  Penicillin acylase is widely used in semi?synthetic antibiotics and intermediates preparation, separation of chiral compounds and peptide synthesis. The high efficient immobilization, which can enhance the adaptability of penicillin acylase to temperature, pH, polarity and the stability of its reuse, will become an inevitable choice and key for lengthening the life?time of penicillin acylase. We review the progress on the techniques of immobilizing penicillin acylase, and discuss their characteristics and catalysis in different reaction media. Furthermore, the perspectives of penicillin acylase are also presented.

    KEY WORDS  Penicillin acylase;  Carrier;  Immobilization;  Reaction medium;  Application of immobilized enzyme

    1  固定化的载体

    有效固定是固定化青霉素酰化酶的核心技术，载体的材料选择与制备是技术的关键。性能优越的载体能提高固定化酶的催化性能，降低酶法生产成本。

    1.1  有机高分子载体    有机载体具有较好的机械强度且已产业化。天然有机高分子载体无毒性、传质性能好，常用甲壳素和壳聚糖［2］。合成的有机高分子强度大，但传质较差，如聚乙烯醇［3］和聚丙烯酰胺［4］等。Mateo等［5］选用EP?Sepabeads类高密度环氧结构的载体固定青霉素酰化酶，过程如图1所示。Pasini等［6］研究Eupergit C载体固定化酶，催化活力较游离酶明显增加，重复使用稳定性好。

    1.2  无机分子载体

    随着材料学的迅速发展，出现了具有多维孔道结构介孔分子筛的载体，可制备高活性高稳定性的固定化酶。何静等［7］报道的介孔分子筛MCM?41具有高比表面积、较小扩散阻力的特点，可吸附固定，也可利用载体表面醛基与酶蛋白的氨基相互反应共价连接。Roger等［8］实验表明MCM?41载体的孔径(3～3.5nm)明显小于青霉素酰化酶尺寸(7nm×5nm×5nm)，载体可大部分与酶以吸附形式固定。Roger等研究了硅载体通过交联剂与酶共价固定的过程，如图2所示。此硅载体孔径较大，固定化酶的干酶活力达110BPUg-1，活力回收80%，热稳定性明显优于Eupergit C固定化酶。薛屏等［9］以MCM?48介孔分子筛为载体，固定青霉素酶12h，相对活力65.10%；肖清贵等［10］研制的中空硅微管载体，负载率和活力回收分

    图1    青霉素酰化酶与高密度环氧载体共价结合过程别为97.20%和88.80%；Bernardino等［11］研制的磁性硅载体可减少扩散阻力，便于催化剂分离回收；王卫等［12］研究的磁性环氧颗粒载体最适pH和温度分别为8.5和45℃，交联密度为30%，固定化酶经使用80次仍保持94.2%的催化活力。

    采取对无机载体先表面修饰再与酶固定的方法，性能有很大提高。本课题组曾采用表面氨基的介孔二氧化硅固定青霉素酰化酶［13］，相对活力达90%以上，循环使用10次后催化活力仍保持初始条件的94%。此外选用介孔泡沫硅(MCFs)载体固定青霉素酰化酶，制得的MCFs载体［14，15］经电镜检测，颗粒表面密集分布大量孔道，孔径较大呈泡沫状。由BET法得到MCFs的比表面积为331.43m2/g。由BJH公式计算得到的孔体积及平均孔径分别为2.16cm3/g和26nm。固定化酶负载率约95%，催化活力最高达200U/mg以上，载体性能较好。

    1.3  复合载体

    有机载体和无机载体各有优势。有研究立足于结合这两种材质的载体，改进材料的性能，如针对壳聚糖颗粒机械强度不够和比表面积不大的缺点，用无机多孔材料硅藻土在低压下强化吸附壳聚糖以固定青霉素酰化酶，优化机械强度，固定化酶性能得到提高［16］。

    2  青霉素酰化酶的固定化方法

    固定方法的选择是酶与载体固定过程的关键步骤。载体固定通常有吸附法、包埋法和共价偶联法；无载体固定法常用无载体交联酶和交联酶聚集体两种，不同固定化方法优缺点如表1所示。

    2.1  载体固定法

    吸附法通过载体表面与酶表面次级键互相作用固定，可分为物理吸附和离子吸附。物理吸附要求载体表面对蛋白质有高吸附性。离子吸附是利用酶解离状态

    图2    带氨基的硅载体与青霉素酰化酶共价固定的过程        表1        不同固定方法的原理及优缺点

    分  类  方  法      优      点        缺    点        载体固定法吸附法条件温和，操作简便酶负载强度低，易失活［17］包埋法酶本身不参与结合，简单易行扩散阻力问题，酶包埋中易失活［18］共价偶联法具有良好的稳定性酶活损失很大［19］无载体固定法

    无载体交联酶

    (CLECs)

    酶载容量较高，利于底物扩散产物分离。在合成中能获得较高反应速率，晶体颗粒小，在高剪切力和液体运输下具有良好的机械稳定性和化学稳定性。比固定化酶制备过程复杂

    ［8，20］

    交联酶聚集体

    (CLEAs)

    避免耗时纯化，酶不易破坏可回收使用，催化水解重复20批次可保持100%活力。半合成抗生素产率高。对于较大分子量的酶形成聚集

    体效果不佳

    ［21～26］

    下与载体的电荷正负相吸原理固定酶。包埋法［18］将酶包埋进载体孔径内固定，酶本身并不参与结合。共价偶联法是利用酶的非必需侧链基团与载体的功能基团形成稳定的共价键而固定。本课题采用MCFs载体、交联剂对苯醌和青霉素酰化酶共价结合，经0.1mol/L NaCl溶液洗涤后，固定化酶负载率和酶活与未洗涤的固定化酶相比没有明显下降，证明载体MCFs与青霉素酰化酶是共价而非吸附固定。

    2.2  无载体固定法

    (1)交联酶晶体(CLECs)  晶体晶格中蛋白质浓度接近理论极限，浓缩的蛋白形成晶体，通过戊二醛等多功能试剂将酶永久交联，分子中静电反应和疏水反应数量增加，明显增强了蛋白质的稳定性。交联酶晶体可用于多肽合成、酶传感器、化妆品和洗涤剂等需要高稳定性和高活性蛋白质的领域，应用前景广泛。

    (2)交联酶聚集体(CLEAs)  CLEAs的活性和稳定性可与CLECs相媲美。在CLEAs制备中，浓缩的酶蛋白会发生物理聚集而形成超分子结构，加入无机盐、有机溶剂或其他大分子试剂可使其聚集体沉淀析出，能保持酶的三维构象和活性。再用多功能交联剂将该酶聚集体交联捆绑形成CLEAs。CLEAs催化的高效转化率和高效可循环再利用的特点，有利于实现固定化青霉素酰化酶的工业应用价值。

    3  不同菌属青霉素酰化酶的固定化条件

    不同菌属所产青霉素酰化酶可能对应不同的固定化条件。大规模生产青霉素G酰化酶的菌种有巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、埃希菌属大肠埃希菌(Escherichia coli)、雷氏普罗威登菌(Providencia rettgeri)和粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)等，尤以前两种最常见。产青霉素V酰化酶的菌种多为淡紫链霉菌(Streptomyces lavendulae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、球形杆菌(Bacillus sphaericus)和气单胞菌属(Aeromonas)等。

    酶的固定化条件包括pH、温度、离子强度及载体性能等。固定化时所选缓冲液的pH应与酶的等电点和载体表面所带电荷有关［27］。当酶分子表面与载体所带电荷相反时，相互间的静电引力可使酶固定化过程加快，提高酶的负载量，缓冲液的pH应接近于酶的最适pH。不同来源的酶分子量迥异，如大肠埃希菌青霉素G酰化酶含20.5kDa的α亚基和69kDa的β亚基；球形杆菌青霉素V酰化酶分子量约为35kDa［28］，其中相对较小的酶分子更易包埋进载体，或吸附共价组装进介孔类载体。常用功能性试剂修饰载体以改善其性能，优化固定效果。Chong等［29］将青霉素酰化酶吸附于不同硅烷试剂修饰的介孔载体，结果表明选用乙烯基修饰表面的介孔载体固定酶时，固定化酶相对活力达到200%。

    不同菌种来源的青霉素酰化酶固定化条件的选择并未有系统的报道，也没有很强的专一性，而是根据酶本身及载体的性质创造酶固定的最适条件。不同来源酶的固定化条件如表2所示。本课题将巨大芽孢杆菌胞外青霉素G酰化酶(等电点7.8)溶于pH8.0的磷酸缓冲，室温组装进MCFs(平均孔径26nm)载体，制备得到性能优越的固定化酶。

    4  青霉素酰化酶的固定化技术

    随着载体和固定方法的发展，酶的固定化技术也有创新。据报道，青霉素酰化酶固定化方法有常规法［34］和紫外照射法［35］，脂肪酶固定化曾采用超声波法［36］。表3比较了这几种传统固定化方法的优缺点。

    本课题研究微波法固定青霉素酰化酶，采用美国CEM公司Mars5微波反应器，固定过程只需2min，酶负载率高达95%以上，活力回收和相对活力均远超100%。可能因为酶蛋白和水均是极性分子，微波作用下引起剧烈的极性振荡，增加青霉素酰化酶的游离氨基与载体结合的机会，增加反应传质速率。微波辐射提供的能量可使酶蛋白在空间结构上扭曲形成新的构象［37］，共价固定化后活力中心充分暴露，酶促反应加速，固定化酶活性明显增强。        表2        不同来源青霉素酰化酶的固定化条件

    菌      种          〖〗酶pH温度载    体      文献Fusarium oxysporum (FP941)PVA7.025℃  环氧丙烯聚合物［30］Streptomyces lavendulae (ATCC13664)PVA8.0-  Eupergit C共价［31］Bacillus megateriumPGA6.340℃  添加交联剂戊二醛的MCM?41［7］Bacillus megateriumPGA7.8室温  介孔材料SBA?15/130［32］Escherichia coliPGA8.3室温  Eupergit C［33］Escherichia coliPGA7.0-  CMC［17］

    表3        传统固定化方法比较

    分  类方    法      优    点        缺    点    文献常规法常温摇床振荡24～72h存储稳定性好固定周期太长［34］紫外照射法

    紫外照射酶与含醛基的光敏高分子混合物酶被光交联凝胶包埋，与载体骨架共价结合，提高固定化酶的稳定性扩散阻力问题，酶易失活［35］

    超声波法

    形成粒子的机械振动

    含能量的超声振动比机械搅拌有更好促进和传质作用，提高反应速率和产率超声对酶分子产生影响

    ［36］

    微波法

    磁力搅拌下微波反应

    高效，利于酶催化活力增强，降低反应活化能

    微波过久破坏共价键影响酶活中心［15，37］

    5  固定化青霉素酰化酶的介质工程

    传统的游离状态的青霉素酰化酶通常在水相中催化，当今固定化酶催化更致力于非水相的研究。本文重点综述了固定化青霉素酰化酶在有机相、离子液体和浊点体系中的催化性能。

    5.1  有机介质

    有机介质中的酶反应活性位点与水中相同，用位点专一性试剂对活性位点共价修饰，酶的催化活性消失。由Hammett效应分析和相应的线性自由焓关系(LFERs)可知，有机溶剂与水溶液中酶的反应机制大致相同。有机溶剂的物性参数为酶促反应介质的选择提供了依据，比如挥发性、分子摩尔质量、电容量(介电常数ε)、疏水性(logP)和电荷分布(偶极矩μ)等，其中logP值对酶的催化活性有影响，介电常数ε和偶极矩μ与对映选择性E有较好的相关性［38］。

    有机溶剂具有增强反应物溶解度、改变化学平衡、改变酶催化微环境、增加酶的稳定性、改变酶的选择性等明显优势［39］，但目前未达到产业化水平。Miguel等［40］研究固定化青霉素酰化酶在不同有机溶剂中的催化性能，醇类有乙醇、丙三醇、乙二醇等，疏质子溶剂有丙酮、DMSO、DMF等，其中以乙二醇为介质的固定化酶催化性能最优。Miguel还研究不同有机介质浓度对酶催化活力的影响。0～60%有机相中固定化酶活力高于水相，20%～40%内比活更大于200%。Fernandez等［41］研究在固定化酶过程中加入右旋葡聚糖类或聚乙烯亚胺［42］等大分子物质，改变蛋白质周围环境的亲水性，增加固定化青霉素酶的催化活性。大分子试剂通过拥挤效应可稳定溶液酶蛋白构象［43］，酶在细胞内的催化活力远远大于细胞外，可根据酶的仿生效应模拟细胞内的环境［44］。

    本课题研究了固定化青霉素酰化酶在非水相中催化水解反应和大分子物质拥挤效应。通过有机溶剂的筛选，发现在低极性的环己烷、异辛烷、石油醚、1，4?丁二醇、四氯化碳和高极性的丙三醇等有机溶剂中固定化酶比活均达150U/mg以上。研究不同浓度有机溶剂对酶活的影响，发现增大有机溶剂比例对产物有浓缩作用，更易于产物6?APA和苯乙酸的分离。加入BSA、Ficoll70、Dextran 10000［45］等大分子测得的固定化酶比活高达200U/mg以上。

    5.2  离子溶液

    离子液体是由特定阳阴离子构成的液态物质(图3)，具有挥发性低、产物无污染和绿色环保等优势。与传统的有机溶液不同，离子液体无蒸汽压，有很好的溶解性，热稳定温度范围宽，超过液态温度范围(≤300℃)，离子液体还可以与许多溶剂组成双相体系。

    张卫国等［46］研究青霉素酰化酶在离子溶剂中的反应时发现［bmim+］［PF6-］与水的两相体系比水相更适合催化水解生成6?APA，此发现为离子相中半合成青霉素开辟了新前景。Antonia［47］等实验发现青霉素酰化酶在［emim+］［Tf2N-］等离子液体中的稳定性很好，半衰期达23h，是在2?丙醇中催化的2000倍。［bmim+］［PF6-］中青霉素G酰化酶的半衰期达到最高增幅，是纯底物溶剂中半衰期的9倍。Jiang等［48］研图3    离子液体结构图

    究［bmim+］［PF6-］与［bmim+］［BF4-］混合离子液体与NaH2PO4的双相体系。青霉素酰化酶水解产生的6?APA于pH5时沉淀于水相，副产物苯乙酸转移至离子液体，能减少产物抑制且易分离。青霉素酰化酶在离子液体?水双相体系的催化性能和稳定性，均优于相似的乙酸乙酯?水双相体系(pH=4)。

    离子液体作为非水相的一种新介质，不只代替有机溶剂，通常还能改善工艺过程，并且溶解底物范围广，在许多离子液体为介质的酶促反应中都得到较好产率、选择性和稳定性。离子液体的广泛研究将为半合成β?内酰胺抗生素的生产和手性化合物的拆分开辟新道路。

    5.3  浊点系统

    非离子表面活性剂溶液在温度高于其浊点或有一定添加物存在的条件下可自动形成表面活性剂浓度很小的稀相和富含表面活性剂的凝聚层相，这一系统常称为浊点系统，应用于萃取分离。其特殊的相结构使凝聚层相具有很高的含水率，从而提高生物催化剂在系统中的稳定性。王丽等［39］用青霉素酰化酶催化制备6?APA，发现浊点系统的酶促反应稳定性较有机溶剂有明显提高；Wang等［49］发现浊点系统对青霉素酰化酶水解副产物苯乙酸具有较强的萃取能力，促进酶促反应生成6?APA；郭雅静等［50］实验得出较高pH(5～8)时浊点系统中固定化酶稳定性较好。水解物系的分配和固定化酶的稳定性预示着浊点系统广泛应用于酶法水解青霉素工艺的潜力。

    6  固定化青霉素酰化酶的应用

    6.1  酶法制备6?APA和7?ADCA

    碱性条件下青霉素酰化酶催化水解可生成半合成β?内酰胺类抗生素所需中间体6?APA(如图4所示)和7?ADCA。酶法催化具有效率高、环保易分离、可重复使用以降低成本的优势。非水相对固定化青霉素酰化酶的酶促反应具有增大底物和产物浓度的作用，使反应向预期的方向进行，增加反应速率，便于产物6?APA及副产物苯乙酸的提取和分离。

    6.2  酶法合成

    用6?APA、7?ADCA等中间体与新的D?氨基酸类在酸性条件下可合成各种具有新的抗菌活性和抗菌谱的半合成抗生素。固定化酶的酶法合成具有反应条件温和、工艺操作简单、无需基团保护等优势。已报道的酶法合成产品有阿莫西林［51］、头孢氨苄［52，53］和氨苄西林［54］(图4)等。热力学分析推测固定化青霉素酰化酶在非水相中的合成产率高于水溶液，可避免游离酶的不稳定性，但影响酶构象。动力学分析合成过程不可避免地发生酶解反应，最终达到动态平衡，生产中此过程对高产率的获得很不利。补充高浓度的侧链供

    图4    酶法催化水解制备6?APA和半合成氨苄青霉素体和母核可减少水解的发生。可通过提取产物促进酶促合成的正向进行，也可加入少量如苯乙酸类的抑制剂，降低侧链供体与母核的投料量，极大地提高了产率。

    除制备半合成抗生素外，青霉素酰化酶还能催化醛醇缩合反应，如Fu等［55］研究的别嘌呤醇与乙酸乙酯的马氏加成反应，发现经青霉素酰化酶催化的酶促反应初速率是未加酶的55.4倍，固定化酶的反应速率达到118倍。此研究为固定化青霉素酰化酶合成生物活性的含氮杂环衍生物等物质开辟了新途径。

    6.3  手性化合物的拆分

    青霉素酰化酶可用于拆分手性化合物的外消旋混合物，包括氨基酸［56］、胺［57］、仲醇等，其对L型氨基酸有较高选择性，拆分所得单一对映体可用于合成生物中间体。黄冠华等［58］用固定化青霉素酰化酶拆分D，L?苯丙氨酸以制备D?苯丙氨酸，经消旋化处理能获得100%消旋的D?苯丙氨酸，效果优于其他酶，对pH耐受能力强，对氨基酸有较好的立体选择性。刘书来等［59］研究水?有机体系中不同浓度有机溶剂对拆分叔亮氨基酸反应速度的影响，考察LogP与有机相浓度的变化趋势，最终得到产率95%的L?叔亮氨酸，旋光度大于99%。魏东芝等［60］考察青霉素酰化酶手性拆分R，S?苯丙氨酸，得到的S型、R型苯丙氨酸对映体过量值(ee)分别为98%和99%，简单过程即可分离。

    6.4  多肽合成中脱保护

    固定化青霉素酰化酶还可用于有机合成中活性基团的保护。有机合成中常用酰化方法保护?OH或?NH2，利用固定化青霉素酰化酶温和条件下水解，除去酰化的保护基，起到脱保护作用［61］。

    随着我国医药工业的迅猛，青霉素酰化酶的固定化研究将继续深入。

    (1)载体的适当选择及与酶种类的优化组合有利于固定化酶的活力和稳定性的提高。仅仅靠本领域的方法以求突破，是远远不够的，需要交叉学科相互通融，如采用超声、微波法等技术，利于高效优质的固定化酶的获得。

    (2)稳定性研究。青霉素固定化酶的热稳定性、重复使用稳定性和存储稳定性有待进一步探索，未来的研究将致力于微观酶分子结构，与载体等周边环境的相互作用，了解催化反应的机理。

    (3)大分子拥挤效应。通过大分子物质对酶构象影响的研究发现，大分子的模拟酶仿生效应对酶活力有一定提高作用，具有很好的应用和研究价值。大分子物质种类和添加量需要优化。

    (4)有机相中的酶促反应。青霉素固定化酶在非水相中显示出较好的酶活性，为特殊或极端环境中的应用开辟新天地。可考察溶剂参数寻求合适的有机相种类，探索合适有机相的作用机理。

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