氯离子对东方拟无枝酸菌发酵产物的影响

               作者：周雨朦  洪文荣 阮林高  陈代杰 戈梅

【摘要】  本文研究了氯离子对东方拟无枝酸菌发酵产物的影响。在常规培养条件下，改变发酵培养基中氯离子存在形式或是添加抑氯剂和溴化钠，都发现了新组分无氯万古霉素(didechlorovancomycin，DDCV)的产生。通过对培养基中添加抑氯剂的量的改变，发现加入0.005% 2?巯基苯骈噻唑和0.1%溴化钠时万古霉素产量降至对照的6%，而DDCV的相对含量达到62%。

【关键词】  无氯万古霉素； 抑氯剂； 溴化钠

    ABSTRACT  This study focused on the effect of chorine on the fermentation products of Amycolatopsis orientalis. Changing the form of inorganic salt of Chloride anion or adding its inhibitor and NaBr into the medium, a new component——didechlorovancomycin (DDCV) was found. An optimum fermentation medium was obtained in which 0.005% inhibitor and 0.1% NaBr was added, while the vancomycin yield decreased to 6%, and the relative content of didechlorovancomycin was reached up to 62% as compared to the control respec?tively.

    KEY WORDS  Didechlorovancomycin (DDCV);  Inhibitor of Cl;  Sodium bromide

    收稿日期：2007?09?03    修回日期：2007?11?27

    作者简介：周雨朦，女，生于1982年，在读硕士研究生。    * 通讯作者，E?mail:hongwr56@tom.com    万古霉素(vancomycin)是由东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)发酵产生的一种糖肽类抗生素［1］，是目前临床上用于耐甲氧西林金葡菌(MRSA)引起的严重感染的重要药物［2］。但是，随着耐万古霉素的金葡菌(VRSA)和肠球菌(VRE)的出现，导致临床上治疗感染性疾病又出现了新的棘手问题，严重威胁着人类的生命健康。我们从研究万古霉素的结构类似物入手，寻找新的对耐药菌更有效的药物。

    在研究万古霉素组分的过程中，在某培养基的发酵产物中发现了一个含量较低的未知组分，针对该组分进行研究，最终确定此组分为无氯万古霉素(didechlorovancomycin，DDCV)。在发酵优化方面，借鉴上生产四环素的方法， 在培养基中添加抑氯剂和氯的竞争性抑制剂，可获得较高产量的无氯万古霉素。

    1  材料与方法

    1.1  菌株

    东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)HCCB10007(上海来益生物药物研发中心保藏)。

    1.2  试剂和仪器

    本实验所用试剂纯度均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。HPLC型号：Agilent 1100 Series公司；MS型号：Q?TOF micro (Waters公司)。

    1.3  培养基

    (1)斜面培养基  高氏一号合成培养基。

    (2)种子培养基(%)  可溶性淀粉4.0， 黄豆粉2.0，葡萄糖1.5，硝酸钾1.5，磷酸二氢钾0.02，硫酸镁0.02；消前pH6.8。

    (3)发酵培养基(%，自来水配制)  甘油6.0，硝酸钾1.5，磷酸二氢钾0.03，氯化镁0.06，碳酸钙0.3；消前pH6.2。

    1.4  培养条件

    (1)斜面培养条件  培养温度28℃，相对湿度40%～60%，培养5d。

    (2)种子摇瓶培养条件  培养温度28℃，相对湿度40%～60%，装量25ml/250ml三角瓶，摇床转速220r/min，培养48h。

    (3)发酵摇瓶培养条件  培养温度28℃，相对湿度40%～60%，装量25ml/250ml三角瓶，摇床转速220r/min，接种量8%，培养120h。

    1.5  无氯发酵实验、组分取代实验和抑氯剂添加试验

    (1)无氯发酵实验  以发酵培养基作为对照，用去离子水配制发酵培养基，考察以等量的硫酸镁取代氯化镁对万古霉素及其他组分合成的影响。培养条件同1.4。

    (2)组分取代试验  以发酵培养基作为对照，用去离子水配制发酵培养基，分别考察以等量的硫酸镁、氯化钠、氟化钠、溴化钠代替氯化镁对万古霉素及其他组分合成的影响。培养条件同1.4。

    (3)抑氯剂添加试验  以发酵培养基作对照，然后在对照培养基中加入不同浓度的2?巯基苯骈噻唑和溴化钠，考察添加物对发酵结果的影响。培养条件同1.4。

    1.6  发酵组分和效价测定

    发酵液中万古霉素及其相关产物的含量分析参照2000版《美国药典/国家处方集》(USP24/NF19)中万古霉素的HPLC分析方法进行。

    1.7  生物活性测定

    参照《药典》2000版二部附录XI中的方法。

    2  结果与讨论

    2.1  无氯发酵实验

    试验发现无氯培养基的发酵液中万古霉素含量远远低于自来水配制的对照组，经HPLC分析还发现了一个新的组分，将其记作V13。HPLC图谱见图1。

    2.2  V13组分的分离、鉴定及理化性质

    为了对新组分V13做进一步的研究，通过发酵积累、分离纯化，获得纯度为94%以上的新组分V13，经质谱分析显示分子量为1379D，其分子量与万古霉素比较相差68D，相当于2个氯原子。由于发酵培养基中去除了氯离子，因此结合此发酵方案，理性推断V13为无氯万古霉素，其化学结构如图2所示。DDCV外观为白色粉末，略带棕色；易溶于水，微溶于甲醇，不溶于丙酮与乙醚。

    2.3  组分取代实验

    以若干不同无机盐分别替代发酵培养基中的氯化镁组分，各相关组分对产生无氯万古霉素(DDCV)的影响见表1。

    表1    不同发酵培养基发酵结果(%)

    培养基类型对照硫酸镁氯化钠氟化钠溴化钠  万古霉素相对含量1002521312  DDCV相对含量  096723

    图1    对照和无氯发酵的HPLC图谱

    图2    V13的化学结构

    由表1结果可以看出，分别以硫酸镁和氯化钠代替氯化镁时，两者之间万古霉素效价及DDCV含量差别不大，说明氯化镁和氯化钠中的氯离子对万古霉素生物合成影响并不大。两者与对照相比区别在于前者采用去离子水配制而对照采用自来水配制，推断万古霉素中的氯元素主要来源于自来水。当以溴化钠替代去离子水配制培养基中的氯化镁时，发酵液中DDCV的含量最高，说明溴化钠对氯原子的加入有抑制作用，有利于DDCV的合成。而氟化钠可能对细胞毒性太大，影响了菌体的生长。

    2.4  加入2?巯基苯骈噻唑、溴化钠对发酵结果的影响

    上生产四环素时，为抑制氯原子进入四环素的分子结构中去，通常在培养基中添加抑氯剂(2?巯基苯骈噻唑)和氯的竞争性抑制剂(溴化钠)，两者协调作用，使四环素的含量占到95%以上。

    本实验借鉴四环素生产中的经验，在万古霉素发酵培养基中加入溴化钠和2?巯基苯骈噻唑，考察其对东方拟无枝酸菌相关产物的影响。结果见表2。

    表2结果显示，在发酵培养基中同时加入2?巯基苯骈噻唑、溴化钠能够显著抑制万古霉素的合成，同时发酵液中DDCV含量明显增加；在同时加入0.005% 2?巯基苯骈噻唑和0.1%溴化钠时，万古霉素产量降至对照的6%，而DDCV的相对含量达到62%；该组与对照组的HPLC图谱如图3所示。

    2.5  生物活性测定结果

    DDCV对金葡菌和枯草芽孢杆菌所产生的抑菌圈直径分别为10.7和11.3mm，均低于同浓度下万古霉素的抑菌圈直径(分别为18.7和22.4mm)。体外抑菌试验证实，该化合物具有一定的抑菌效果，但明显弱于同剂量的万古霉素。

    表2    2?巯基苯骈噻唑、溴化钠对发酵产物的影响

    培养基中I、N含量  相对含量(%)万古霉素DDCV        010000.005% I+0.05% N12490.005% I+0.1% N  6620.005% I+0.2% N  5510.01% I+0.05% N  5470.01% I+0.1% N  6430.01% I+0.2% N  4380.02% I+0.05% N  6360.02% I+0.1% N  4310.02% I+0.2% N  327

    I：2?巯基苯骈噻唑；  N：溴化钠。

    3  讨论和结论

    前人在万古霉素结构类似物的研究中有关于无氯万古霉素的报道［3］，但均是采用化学的手段获得；本试验首次通过微生物发酵的手段在东方拟无枝酸菌的发酵液中直接得到了产物DDCV。万古霉素生物合成中的氯是由卤化酶［3～5］作用，通过一系列反应连接到万古霉素肽骨架上的。本研究中未发现含单个氯原子的万古霉素类化合物，说明万古霉素的氯化反应可能是由一个酶催化的两个同时的加氯反应。

    万古霉素化学结构中含有两个氯原子，分别位于2和4位芳香族氨基酸——间?氯?(?羟基酪氨酸(CHT)的支链上，其中2位氨基酸上的氯能促进万古霉素二聚体的形成，是万古霉素发挥作用的一个功能团。因此，DDCV的抑菌活性的降低可能是由于万古霉素中2位氨基酸上的氯被去除后，影响了万古霉素二聚体的形成所致［6］。虽然氯在万古霉素的活性功能上起着一定作用，但氯元素的存在也与许多化合物的毒性有关系，所以近年来在研究抗生素的结构改造上，

    图3    对照组和与添加0.005% I+0.1% N组的HPLC图谱

    一项重要内容就是去除氯原子或以氟原子替代氯原子。虽然无氯万古霉素的体外活性低于万古霉素，但将无氯万古霉素作为化学修饰的前体进行修饰有实际应用价值；本研究为研究万古霉素卤化过程和提供方便的合成前体创造了条件。

【】
  ［1］ James J, Alan T, Alan W. Vancomycin production in batch and continuous culture ［J］. Biotechnol Bioeng,1996,49(4):412～ .

［2］ Ramakrishnan N. Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and related glycopeptides ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1991,35(4):605～ .

［3］ Williams D H, Bardsley B. The vancomycin group of antibiotics and the fight against resistant bacteria ［J］. Angew Chem Int Ed,1999,38:1172～1193.

［4］ Dong C, Flecks S, Unversucht S, et al. Tryptophan 7?halogenase (PrnA) structure suggests a mechanism for regioselective chlorination ［J］. Science,2005,309:2216～2219.

［5］ Dong C, Kotzsch A, Dorward M, et al. Crystallization and X?ray diffraction of a halogenating enzyme, tryptophan 7?halogenase, from Pseudomonas fluorescens ［J］. Biological Crystallography,2004,60:1438～1440.