长春市金葡菌耐药状况及耐甲氧西林金葡菌基因分型

                作者：姜秀虹 牛俊奇 王辉， 孙宏莉 王峰 续薇 许建成 段琼 

【摘要】  目的 调查长春地区临床分离金葡菌的耐药状况及Panton?Valentine杀白细胞素(PVL)分布情况；确定耐甲氧西林金葡菌(MRSA)染色体及葡萄球菌mec盒式染色体(SCCmec)基因分型。方法 琼脂稀释法测定苯唑西林等17种抗菌药物对2004年6月～2005年1月长春市3家教学临床标本分离的83株金葡菌的最低抑菌浓度(MIC)；聚合酶链式反应(PCR)进行金葡菌的PVL基因检测；脉冲场凝胶电泳(PFGE)对MRSA菌株作染色体同源性分析，多重PCR方法检测MRSA的SCCmec基因分型。结果 83株金葡菌中MRSA 12株(占14.5%)；金葡菌PVL的基因阳性7株(占8.4%)。MRSA对β?内酰胺类、红霉素、克林霉素、庆大霉素、四环素、氟喹诺酮类耐药率均超过90%，对氯霉素、利福平耐药率分别为8.3%、58.3%，未发现对糖肽类及复方磺胺甲口恶唑耐药的MRSA。甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)对青霉素G、红霉素、克林霉素、四环素、庆大霉素耐药率分别为95.8%、67.6%、49.3%、45.1%、26.8%，对头孢菌素、氯霉素、利福平、氟喹诺酮类、复方磺胺甲口恶唑耐药率均低于20%。MRSA的PFGE显示为A、B两种类型，以A型为主，占92%(11/12)，三家医院均有分布。MRSA的SCCmec分型，III型为主75%(9/12)。结论 长春市MRSA发生率低于国内报道平均水平；MRSA为两种不同类型克隆株，在不同医院间存在克隆传播；未发现社区获得性MRSA菌株。

【关键词】  耐甲氧西林金葡菌； 葡萄球菌基因盒染色体； 杀白细胞素； 社区获得性耐甲氧西林金葡菌

    ABSTRACT  Objective  To investigate the antibiotic resistance pattern and distribution of Panton?Valentine leucocidin (PVL) of Staphylococcus aureus isolates, and determine the genotypes of methicillin?resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Changchun.  Methods  Agar dilution method was used to determine the minimal inhibitory concentrations (MICs) of 17 antibiotics against 83 strains of S.aureus in three teaching hospitals from June 2004 to January 2005 in Changchun. The PVL locus of S.aureus strains was detected by polymerase chain reaction (PCR). The genotypes of MRSA strains were characterized by using pulsed?field gel electrophoresis (PFGE), and staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) was genotyped by multiple PCR method.  Results  The incidence of MRSA was 14.5% (12), and 7 (8.4%) were positive for the PVL locus in 83 isolates of Staphylococcus aureus. The resistant rates of MRSA to β?lactam, erythromycin, clindamycin, gentamicin, tetracycline, ciprofloxacin, levofloxacin, and moxifloxacin were more than 90%, and to chloramphenicol and rifampin were 8.3% and 58.3% respectively. All MRSA strains were susceptible totrimethoprim/sulfamethoxazole and glycopeptides. The resistant rates of methicillin?sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) to penicillin G, erythromycin, clindamycin, tetracycline and gentamicin were 95.8%, 67.6%, 49.3%, 45.1% and 26.8% respectively, and to other antibiotic were less than 20%. PFGE analysis of the 12 MRSA isolates revealed two major types (A and B) and type A was classified into four subtypes (type A1～A4), and the A?type DNA pattern (92%) was found in three hospitals. The most frequent SCCmec types were type Ⅲ(75%).  Conclusions  The incidence of MRSA in Changchun was below the domestic average. There were two different MRSA clones in Changchun, and one epidemic clone covered in this city. Community?acquired MRSA (CA?MRSA) strain was not found in this study.

    KEY WORDS  Methicillin?resistant Staphylococcus aureus;  Staphylococcal cassette chromosome mec; Panton?Valentine leukocidin;  Community?acquired methicillin?resistant Staphylococcus aureus

    细菌耐药已成为全球医药界面临的严峻问题，不同国家和地区的医院耐药性均有各自的特点，耐药性监测对指导当地临床合理用药具有重要意义。金葡菌是临床常见致病菌，具有多重耐药特点的MRSA感染一直是国内外研究的热点，尤其是近年来因其流行病学的显著变化，使社区相关或社区获得性MRSA(CA?MRSA)菌株感染迅速浮出水面，欧美等国的研究日新月异，但国内研究尚少。本文对长春市三家医院临床分离金葡菌进行耐药表型检测的基础上，应用分子生物学方法检测其耐药基因及特殊的毒力因子。

    1  材料与方法

    1.1  细菌

    搜集2004年6月～2005年1月长春市3所三级甲等医院(吉林大学第一医院、吉林省人民医院、吉林大学第三医院)临床标本中分离的金葡菌，所有菌株均经北京协和医院细菌室重新复核和鉴定，用于本研究。本研究共搜集金葡菌83株。头孢西丁抑菌圈直径≤19mm的金葡菌进一步应用mecA?femB双重PCR法确认MRSA［1］，计12株(14.5%)。质控菌株由北京协和医院细菌室提供：金葡菌ATCC29213及ATCC25923为甲氧西林敏感株，金葡菌ATCC43300为甲氧西林耐药株。

    1.2  抗菌素标准粉

    青霉素G(PCG)、苯唑西林(OXA)、头孢唑林(CEZ)、红霉素(EM)、四环素(TC)、氯霉素(CP)、克林霉素(CLI)由利福平(RFP)由药品生物制品检定所提供；头孢西丁(CFX)购自美国Sigma公司；环丙沙星(CPLX)和莫西沙星(MXLX)购自德国Bayer公司)；左氧氟沙星(LVLX)由日本Daiichi公司生产；加替沙星(GTLX)为南京圣和公司产品；庆大霉素(GM)为天津金耀产品；万古霉素(VCM)由日本Eli Lilly公司生产；替考拉宁(TEC)由Aventis公司生产；复方磺胺甲口恶唑购自中国生物制品检定所。

    1.3  体外抗菌活性测定

    用琼脂稀释法测定各种抗菌药物对金葡菌的最低抑菌浓度(MIC)。整个过程参照临床和实验标室准化研究所(CLSI)2005年M100?S15文件［2］中的规定进行；全部药敏结果输入世界卫生组织(WHO)耐药监测组提供的WHONET?5.3软件，分析耐药模式。

    1.4  PVL的筛选

    参照Lina等［3］报道设计引物Luk?PV?1 5′?ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA?3′；Luk?PV?2 5′?GCATCAASTGTATTGGATAGC?AAAAGC?3′；扩增片段长度为433bp。参照Holmes等［4］设计PCR扩增反应体系和条件，采用PCR检测PVL基因。PCR产物送上海生物工程技术服务有限公司测序，以测序结果100%同源株为阳性对照株。

    1.5  MRSA的脉冲场凝胶电泳(PFGE)［1］

    将菌悬液与等量低熔点琼脂糖混匀后制成胶块，以蛋白酶K过夜消化后用SmaI内切酶对染色体DNA消化。电泳条件为14℃，6v/cm，120°，18h，线性梯度5～60s。电泳缓冲液为0.5×TBE。溴化乙啶染色30～40min，紫外灯下观察结果。结果判读按美国疾病控制和预防中心(CDC)Tenover等［5］推荐的方法，图谱完全相同的定义为一个型；彼此之间相差一个带的定义为同一型的不同亚型；相差2～3个带的认为亲缘关系密切；相差4～6个带的认为可能相关；条带相差7个以上的则认为无亲缘关系，为不同型。

    1.6  MRSA的SCCmec基因分型

    SCCmec多重PCR所用引物［6］(Tab.1)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。参照Zhang等［6］报道设计PCR扩增反应体系和条件，采用多重PCR法检测SCCmec基因。阳性对照株由澳大利亚悉尼Westmead医院微生物感染疾病中心(Centre for Infectious Diseases and Microbiology，CIDM)提供。PCR循环基本条件为94℃预变性5min， 94℃变性        Tab.1        Primers used for SCCmec PCR

    Primer      Oligonucleotide sequence    Amplicon size (bp)SpecificityType I?F5′?GCTTTAAAGAGTGTCGTTACAGG?3′613    SCCmec IType I?R5′?GTTCTCTCATAGTATGACGTCC?3′Type II?F5′?CGTTGAAGATGATGAAGCG?3′398    SCCmecIIType II?R5′?CGAAATCAATGGTTAATGGACC?3′Type III?F5′?CCATATTGTGTACGATGCG?3′280    SCCmec IIIType III?R5′?CCTTAGTTGTCGTAACAGATCG?3′Type IVa?F5′?GCCTTATTCGAAGAAACCG?3′776    SCCmec IVaType IVa?R5′?CTACTCTTCTGAAAAGCGTCG?3′Type IVb?F5′?TCTGGAATTACTTCAGCTGC?3′493    SCCmec IVbType IVb?R5′?AAACAATATTGCTCTCCCTC?3′Type IVc?F5′?ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC?3′200    SCCmec IVcType IVc?R5′?TTGGTATGAGGTATTGCTGG?3′Type IVd?F55′?CTCAAAATACGGACCCCAATACA?3′881    SCCmec IVdType IVd?R65′?TGCTCCAGTAATTGCTAAAG?3′Type V?F5′?GAACATTGTTACTTAAATGAGCG?3′325    SCCmec VType V?R5′?TGAAAGTTGTACCCTTGACACC?3′MecA147?F5′?GTG AAG ATA TAC CAA GTG ATT?3′147    mecAMecA147?R5′?ATG CGC TAT AGA TTG AAA GGA T?3′

    45s，65℃退火45s，72℃延伸90s，进行10次循环，再94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，进行25次循环，最后72℃延伸10min，反应结束后，将PCR产物于4℃保存。取3μl PCR反应产物在1×TAE缓冲液，2%琼脂糖中电泳60min，然后在EB中染色40min，扫胶仪观察结果并拍照保存。

    2  结果

    2.1  金葡菌对17种抗菌药物的耐药率及MIC

    MRSA和MSSA对青霉素G均高度耐药；MRSA对其它β?内酰胺类抗生素均高度耐药，MSSA则全部敏感；对庆大霉素、氟喹诺酮类抗菌药、利福平耐药性有显著差异，表现为MRSA耐药，MSSA较敏感；MRSA菌株对糖肽类及复方磺胺甲口恶唑耐药率为0(Tab.2)。

    2.2  PVL筛选结果

    83株金葡菌中7株MSSA菌株PVL基因检测阳性(8.4%)，MRSA菌株均未检测到PVL基因。

    2.3  PFGE结果

  Fig.1显示，MRSA的PFGE有两种类型(A、B型)，以A型为主(11株)，A型又包括4个亚型(A1～A4)，以A1型(6株)为主，3株为吉林大学附属第一标本，分布在神经外科，耳鼻喉科(脓汁标本)；另3株为吉林省人民医院标本，分别为尿液标本，痰标本；A2型2株，为吉林大学附属第三医院标本；A3型1株为吉林省人民医院痰标本；A4型2株，为吉林省人民医院痰标本。B型1株，为吉林省人民医院痰标本。

    3  讨论

    金葡菌是引起感染性疾病的重要致病菌，侵袭性金葡菌感染常可导致患者死亡。20世纪40年代青霉素应用于临床，显著改善了患者预后，甲氧西林等耐酶青霉素可有效抑制耐药株；20世纪60年代出现了遍布世界各地医院的MRSA菌株感染，对所有β?内酰胺类抗生素都耐药，对其它临床常用抗菌药也表现为不同程度耐药。20世纪90年代后期，美国和澳大利亚先后报道社区获得或社区相关MRSA(CA?MRSA)感染［7］，1998年日本学者对CA?MRSA菌株MW2全基因组测序表明CA?MRSA菌株与HA?MRSA菌株具有不同的基因背景。CA?MRSA菌株为SCCmecIVa型，几乎没有任何转座子或插入元件，比HA?MRSA菌株生长快，具有特殊的毒力因子［8］。CA?MRSA发现典型的SCCmecIV和SCCmecV［9］，I、II和III型SCCmec基因主要存在于HA?MRSA中。不同的基因背景导致其耐药表型不同，CA?MRSA菌株对多种非β?内酰胺类抗菌药物敏感［10，11］，而HA?MRSA菌株对β?内酰胺类外多种抗菌药物耐药。临床上一般认为CA?MRSA感染应是自社区发生的感染患者，或在其入院48h内分离得到MRSA菌株，并且该患者以往身体健康，无发生HA?MRSA感染的危险因素，近期亦无医疗保健机构接触史［12］，但如下情况时则易造成混淆：①HA?MRSA菌株感染患者出院后，其中部分患者仍可带菌达数月至数年之久(有报道最长可达40个月)，这些带菌者可能在社区中播散HA?MRSA；②CA?MRSA菌株感染的患者可能需住院，而造成医院内CA?MRSA菌株感染的暴发流行［7］。因此，单纯从临床角度是很难判断MRSA感染的真正来源的，建立正确的实验室诊断手段对正确诊断，针对性治疗，阻断传播均具有重要意义。

    与HA?MRSA相比较CA?MRSA菌株带有PVL毒力基因［8］。PVL(Panton?Valentine leucocidin)是一种杀白细胞的外毒素，由噬菌体携带后与金葡菌染色体结合，可破坏人体白细胞，使人体遭受严重组织破坏，在儿童和成人患者产生坏死性皮肤损害和坏死性肺炎等［3］。据国外报道不足5%的金葡菌可产生此毒素［3］。在本研究中，83株金葡菌中7株PVL基因检测阳性(8.4%)，阳性株均为MSSA，MRSA菌株中未检测到PVL基因。

    国内外有关MRSA感染发生率的报道差异很大，欧洲不同国家间MRSA发生率最低的不到1%，最高的可达80%，国内不同地区和各医院之间也波动在20%～80%之间［13～16］。本研究中长春市MRSA发生率低于国内平均水平，复方磺胺甲口恶唑和氯霉素对其仍较敏感为本地特点。

    编码MRSA的mec基因位于金葡菌染色体mec基因盒SCCmec上，SCCmec为一移动基因系列，它可作为mec基因在葡萄球菌之间水平传播的载体，使MRSA得以传播。同时SCCmec还可能整合除mec基因之外的许多耐药基因，因而MRSA表现多重耐药。SCCmec按内部结构组成的不同分为四种基因型别，不同的型别其耐药特征和流行不一样［17］。本研究中，长春市MRSA菌株为SCCmecII型及III型，以SCCmecIII型为主，占75%。结合PVL阴性和对非β?内酰胺类多重耐药的特点，充分说明本次研究的MRSA菌株为HA?MRSA菌株。虽未发现CA?MRSA菌株，但为将来在实验室及时发现诊断CA?MRSA菌株并阻断其传播提供了可靠的方法。

    PFGE同源性分析的结果表明，长春市存在HA?MRSA同一克隆株在多家医院之间的传播，提醒我们要重视感染控制，采取有效措施防止病原菌在各医院之间的传播，如：患者的转院和转移要监测；每新收一个外院转来的患者，要了解其携带或感染的院内病原菌，及时隔离等。

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