Amicoumacin B对MG63细胞bmp?2转录及蛋白表达作用的研究

            作者：杨兆勇 张志斐 贺小波 杨隽 孙薇 丁艳 司书毅 张月琴

【摘要】  目的 研究amicoumacin B(04?5195A)对骨形态形成蛋白因子II(BMP?2)的作用。方法 采用RT?PCR技术，考察amicoumacin B对人骨瘤细胞MG63的BMP?2转录的影响；应用流式细胞分析技术研究amicoumacin B对MG63细胞BMP?2的表达的影响。结果 Amicoumacin B可在mRNA和蛋白水平增强BMP?2的转录及表达。结论 首次证明amicoumacin B有上调BMP?2的作用。

【关键词】  诺卡菌； Amicoumacin B； BMP?2； 转录； 表达

    ABSTRACT  Objective  To investigate the effect of amicoumacin B on bone morphogenetic protein?2 (BMP?2).  Methods  The effect of amicoumacin B to bmp?2 transcription and expression in MG63 cells were studied by means of RT?PCR analysis and Flowcytometry respectively.  Result  Amicoumacin B can enhance the transcription and expression of BMP?2 at the level of mRNA and protein.  Conclusion  The activity of amicoumacin B on BMP?2 is proved for the first time.

    KEY WORDS  Amicoumacin B;  BMP?2;  Transcription;  Expression

    骨质疏松症是由于破骨细胞(osteoclast)和成骨细胞(osteoblast)间功能协调失衡，使骨溶解超过骨形成所致。骨形态形成蛋白因子II(bone morphogenetic protein?2，BMP?2)在成骨细胞分化过程中起非常关键的作用，除了在骨再生和修复过程中促进成骨细胞的分化并抑制其凋亡外［1，2］，还能募集并诱导骨髓干细胞分化为成骨细胞及软骨细胞，通过钙盐沉积形成新骨；此外BMP?2能促进成骨细胞标志基因OPN、Cbfa1、Col I alpha1、BSP、ALP和fabp4(脂肪酸偶联蛋白4)等的表达［3～5］，因此在很多研究中， BMP?2被视为骨质疏松的重要靶标。

    Amicoumacin B是一个由短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)产生的寡肽类抗生素［1］，曾报道对胃溃疡有一定的保护作用［2］。本研究在应用以bmp?2基因启动子为靶点的新药筛选过程中发现医学院医药生物技术研究所分离得到的诺卡菌属04?5195菌株产生的活性成分04?5195A与amicoumacin B相同，因此本研究首次发现amicoumacin B具有上调BMP?2表达的作用。本文报道在mRNA和蛋白水平上评价amicoumacin B活性的研究结果。

　　1  仪器与试药

    1.1  仪器

    PTC?200 DNA扩增仪，SIGMA3K18高速离心机(美国MJ公司)，REVCO 3000 CO2培养箱，DNA SUB CELLTM电泳槽，DYY?III?6B稳压稳流电泳仪，CSIM紫外分析仪，Multi Imagetm Light Cabinet Filter Position凝胶成像系统，BD FACSCalibur流式细胞仪。

    1.2  材料

    Amicoumacin B由诺卡菌属菌株04?5195发酵液分离纯化制得，其结构经1H和13C核磁共振光谱确证，纯度高于98%；TRIZOL：Invitrogen公司；RT?PCR试剂盒：Invitrogen公司；人骨肉瘤细胞MG63：中国医学科学院医药生物技术研究所保存；山羊抗人BMP?2的单克隆抗体：Santa Cruz公司；FITC标记兔抗山羊二抗：北京中杉公司；其余试剂均为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  细胞培养

    人骨肉瘤细胞MG63为贴壁细胞，约48h传代一次。待细胞长满后，弃旧培养基，加适量0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA(1∶1)溶液，在室温下消化约3min，弃消化液，加入含10% FBS的高糖(DMEM)培养基，用吸管反复轻轻吹打瓶皿底壁，使细胞完全脱离瓶皿底壁，分散为单细胞悬液。再按1∶4比例接种该细胞悬液于新的细胞瓶内，补加适量含血清高糖DMEM培养基(不含任何抗生素)，置培养箱继续培养。培养条件：37℃，5% CO2。

    2.2  引物的设计

    根据已知的人BMP?2的cDNA序列，用Primer Premier 5.0生物软件设计引物，扩增hBMP?2的cDNA片段。

    hBMP?2的扩增引物：

    Sense：5′?GGTCCTGAGCGAGTTCGA?3′

    Antisense：3′?ACACTACGCCACCTGACG?5′

    GAPDH的扩增引物：

    Sense：5′?GGGCTCTCCAGAACATCATC?3′

    Antisense：3′?ACGGGAGTTGCTGGTGAAAC?5′

    2.3  RT?PCR检测BMP?2的转录

    约1×106个MG63细胞贴壁8h，换无血清DMEM，用0、1.0、5.0、10.0、20.0μg/ml amicoumacin B作用12、24及48h，弃培养基，用灭菌PBS洗涤2、3次，用TRIZOL提取总RNA，提取过程按TRIZOL操作指南进行。

    按照两步法RT?PCR试剂盒使用说明，以总RNA为模板、Oigo dT20为引物逆转录合成cDNA；以cDNA为模板进行PCR。扩增条件为：94℃，5min；94℃，1min；58℃，40s；72℃，50s，共30个循环。

    扩增到10个循环后立即暂停扩增，取出PCR管置于冰上，每管加入内参GAPDH的正义、反义扩增引物各0.5μl/管，混匀后再置于扩增仪内继续扩增。将PCR扩增产物与DNA电泳上样缓冲液按5∶1比例混合，在含0.5μg/ml EB的1%琼脂糖凝胶上电泳(恒压100V，1h)。紫外灯下观察电泳结果。结果表明当amicoumacin B浓度为5.0μg/ml，作用时间为48h时，MG63的BMP?2 mRNA转录水平明显上调如Fig.1所示。

    2.4  流式细胞仪检测BMP?2蛋白

    用1.0×107个MG63细胞铺板12h，分别加入0、1.0、5.0、10.0、20.0μg/ml的amicoumacin B，作用12、24及48h，同时设未加药对照和无二抗阴性对照，药物刺激完成后消化并收集细胞，用冷PBS洗涤细胞3次；细胞用4%多聚甲醛室温固定40min，然后加入含0.2% Triton?100，5%血清的PBS 2ml重悬细胞，冰箱放置10min；每个样品分出部分细胞用于作无一抗阴性对照后，加入山羊抗人BMP?2的单克隆抗体1∶40稀释，饱和剂量(100～200μl)加入，冰上放置40min，800r/min，离心3min，用冷PBS 2ml重悬细胞再次800r/min，离心3min，如此洗涤2次，洗去未结合的一抗；加入FITC标记的二抗(1∶100或1∶150稀释)，冰上避光放置40min，800r/min离心3min，去上清，PBS洗涤2次，洗去未结合的二抗；过300目尼龙网，上流式细胞仪检测，每管计数10000个细胞。实验组BMP?2的表达值上调率按下式：

    上调率=(%)(实验组荧光值-无二抗阴性对照组荧光值)未加药对照组荧光值

    结果显示amicoumacin B组荧光值明显大于未加药空白对照组，说明amicoumacin B可上调人MG63细胞BMP?2蛋白的表达(Fig.2)。以浓度5.0μg/ml， 作用1: 12h;  2: 24h;  3: 48h时间24h的上调效果最明显。

    3  讨论

    据报道，amicoumacin B是由短小芽孢杆菌产生［7］的寡肽类抗生素。Shimojima等［8］曾在小鼠实验中证实amicoumacin B对紧张引起的胃溃疡有一定的保护作用。Itoh等［9］曾报道amicoumacin B有抗炎作用，但未见报道对骨形态形成蛋白因子II(BMP?2)的作用。本研究在筛选以bmp?2启动子为靶点的抗骨质疏松新药的过程中发现诺卡菌属菌株04?5195产生的活性成分04?5195A与amicoumacin B相同，因此，本研究所用的amicoumacin B是从菌株04?5195的发酵产物中提取得到的。Amicoumacin B对bmp?2启动子的上调作用为本研究首次发现，为了进一步在基因和蛋白水平上验证amicoumacin B对BMP?2的作用，采用RT?PCR技术和流式细胞术(flow cytometry，FCM)对该化合物的体外活性进行了深入研究。

    在RT?PCR实验中，选择管家基因3?磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为内参，同目的基因在同一反应体系中同时进行扩增，以排除反应体系中可能存在的影响PCR的各种干扰因素，如样本纯度、试剂的影响等。以bmp?2 mRNA的转录量同GAPDH的表达量的比值作为半定量检测数据，用以比较不同药物调节bmp?2 mRNA转录的差异。这种方法比绝对定量法更简单、，也更可靠。结果表明当amicoumacin B浓度为5.0μg/ml，作用时间48h时，MG63的BMP?2 mRNA转录水平被明显上调。

    流式细胞术技术是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，该方法灵敏度高，可以精确地检测细胞量，比较蛋白表达量的差异，尤其适用于测量表达量很低的BMP?2这样的蛋白， 结果表明amicoumacinB可上调人MG63细胞BMP?2蛋白的表达。以浓度5.0μg/ml，作用时间24h的上调效果最明显。

    本研究在mRNA和蛋白水平上验证了amicou?macin B上调BMP?2 mRNA转录及表达的作用，研究结果为今后探讨amicoumacin B在抗骨质疏松方面的药理作用奠定了基础。

【文献】
  ［1］ Garrett I R, Chen D, Gutierrez G, et al. Selective inhibitors of the osteoblast proteasome stimulate bone formation in vivo and in vitro ［J］. J Clin Invest,2003,111(11):1771～ .

［2］ Chen S, Guttridge D C, Tang E, et al. Suppression of tumor necrosis factor?mediated apoptosis by nuclear factor KB?independent bone morphogenetic protein/smad Signaling ［J］. J Biol Chem,2001,276(42):39259～ .

［3］ Vaes B L, Dechering K J, Feijen A, et al. Comprehensive microarray analysis of bone morphogenetic protein 2?induced osteoblast differentiation resulting in the identification of novel markers for bone development ［J］. J Bone Miner Res,2002,17(12):2106～ .

［4］ Zh Y Liu, W B Shi, X H Ji, et al. Molecules mimicking Smad1 interacting with Hoxstimulate bone formation ［J］. J Biol Chem,2004,279(12):11313～ .

［5］ Zheng M H, Wood D J, Papadimitrion J M. What′s new in the role of cytokines on osteoblast proliferation and differentiation ［J］. Pathol Res Pract,1992,188:1104～ .

［6］ Yang Z Y, Sun W, Yang J, et al. Study of the effect of a production of Nocardia 04?5195 amicoumacin B on BMP?2 gene ［J］. Chin Pharm J(药学杂志),2007,42(4):268～ .

［7］ Itoh J, Omoto S, Nishizawa N, et al. Chemical structures of amicoumacins produced by Bacillus pumilus ［J］. Agric Biol Chem,1982,46( ):2659～ .

［8］ Shimojima Y, Hayashi H. 1H?2?benzopyran?1?one derivatives, microbial products with pharmacological activity. Relationship between structure and activity in 6?［［1(S)?(3(S), 4?dihydro?8?hydroxy?1?oxo?1H?2?benzopyran?3?yl)?3?methylbutyl］?amino］?4(S),5(S)?dihydroxy?6?oxo?3(S)?ammoniohexanoate ［J］. J Med Chem,1983,26(10):1370～ .