脱氧核酶抑制细菌TEM-1 β-内酰胺酶基因表达的实验研究

                   作者：刘刚 凌保东 谢勇恩 林丽 赵廷坤 雷军 

【摘要】  目的 观察10-23脱氧核酶对细菌TEM-1酶基因表达的抑制作用。方法 PCR扩增TEM-1酶全编码基因，将其连接入pBK-CMV载体中，并在大肠埃希菌JM109中表达。设计并合成针对blaTEM-1的10-23脱氧核酶、反义寡核苷酸，采用氯化钙法将其分别导入表达blaTEM-1的大肠埃希菌中，观察细菌导入脱氧核酶后，在含氨苄西林(100μg/ml)培养基中的生长活力及β-内酰胺酶活性的变化。结果 10-23脱氧核酶导入表达blaTEM-1的大肠埃希菌后，在含氨苄西林(100μg/ml)的培养基中大肠埃希菌的生长活力明显低于反义寡核苷酸和空白对照组，导入脱氧核酶的大肠埃希菌β-内酰胺酶活性也明显低于反义寡核苷酸和空白对照组。结论 10-23脱氧核酶能特异性地抑制细菌blaTEM-1酶基因表达。

【关键词】  耐药性； β-内酰胺酶； 脱氧核酶； 基因表达

    ABSTRACT  Objective  To investigate the inhibitory effects of 10-23 deoxyribozyme (10-23 DRz) on blaTEM-1 gene expression in E.coli.  Methods  blaTEM-1 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR), the target amplification fragment was cloned into PBK-CMV vector. The recombinant vector was sequenced by Sanger′s dideoxy chain termination composition method. According to the gene sequence of blaTEM-1, 10-23 DRz and antisense oligonucleotides (As-ODN) were designed, synthesized, and introduced into E.coli producing TEM-1 respectively by the CaCl2 procedure, bacterial viability in liquid medium containing ampicillin (100μg/ml) and β-lactamase activity were detected spectrophotometrically.  Results  A600 value of E.coli incubated with 10-23 DRz was lower, compared with that of corresponding group (P<0.05). β-lactamase activity of 10-23 DRz group was also lower than that of corresponding group (P<0.01).  Conclusion  10-23 DRz could specifically inhibit the blaTEM-1 expression in E.coli.

    KEY WORDS  Resistance;  β-Lactamases;  Deoxyribozyme;  Gene expression

     针对细菌产生β-内酰胺酶是导致其对β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因［1～3］，近年来，国内外学者致力于探索抑制β-内酰胺酶的有效措施并研制出了一系列的β-内酰胺酶抑制剂，如克拉维酸，舒巴坦、三唑巴坦等，但随着β-内酰胺类抗生素与酶抑制剂复合制剂在全球范围的广泛使用，对酶抑制剂耐药的β-内酰胺酶也随之不断出现［3］，为临床用药带来巨大困难。探索其它方法、措施以解决β-内酰胺酶所导致耐药问题意义重大，本实验以耐药基因blaTEM-1的mRNA为靶点，观察10-23脱氧核酶作为新型酶抑制剂的抑酶效应，为研制开发新型抗感染性疾病基因药物提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  菌株

    产TEM-1型β-内酰胺酶菌株、大肠埃希菌JM109及PBK-CMV载体为本所保存。

    1.2  主要试剂

    氨苄西林(齐鲁制药厂)； 质粒DNA小量快速制备试剂盒、dNTP、Taq酶和PCR反应配套试剂(上海申能博采公司)；DNA DL2000 Marker、限制性内切酶EcoRI、BamHI和DNA连接试剂盒(宝生物大连有限公司)。

    1.3  主要仪器

    TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；PTC-150型PCR仪及GDS-2000多功能凝胶成像和分析系统(美国MJ Research有限公司)。

    1.4  blaTEM-1片段的PCR扩增

    编码框以外设计blaTEM-1通用引物，(P1：5′-GCGGATCCCATGAGTATTCAACATTTC-3′，P2：5′-GCGAATTCTTAGCGTTGCCAGTGCTC-3′)，引物5′分别引入EcoRI和BamHI酶切位点，由上海申能博彩公司合成。用煮沸法提取DNA，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：先94℃预变性3min，然后进入循环，循环参数为：94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环，末次循环自动延伸7min。取5μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

    1.5  PCR产物的纯化、克隆及表达

    按照PCR产物纯化试剂盒的要求，纯化目的片断，经EcoRI和BamHI酶切与经EcoRI和BamHI酶切后的PBK-CMV(含有卡那霉素抗性基因)连接。连接反应液转化至大肠埃希菌JM109感受态细胞，经含氨苄西林(50μg/ml)/卡那霉素(50μg/ml)的麦康凯培养基筛选。挑取白色菌落，接种于含氨苄西林的LB培养液中，37℃培养过夜。用碱裂解法提取重组菌株中的质粒，经EcoRI和BamHI酶切鉴定。Nitrocefin显色法对重组菌产β-内酰胺酶进行定性检测。

    1.6  核苷酸序列测定及分析

    重组质粒送上海基康生物公司测序，测序结果采用国际互联网上NCBI的BLAST工具进行同源性检索分析。

    1.7  设计合成DRz

    根据blaTEM-1基因序列DNA测序结果，结合“10-23”DRz切割RNA特点，用RNAstructure4.2软件分析mRNA的二级结构，综合分析并设计合成针对靶基因的“10-23”DRz(脱氧核酶：5′-GTTATCACTCA-GGCTAGCTACAACGAGGTTATGGCAGC-3′；As-ODN反义寡核苷酸：5′-GTTATCACTCATGGTT-ATGGCAGC-3′)。经硫代磷酸化修饰，由上海申能博彩公司合成。

    1.8  制备感受态细胞及导入脱氧核酶

    氯化钙法制备重组菌感受态细胞，取5管感受态细胞在冰上融化后，1～4管分别加入15、30、45和60nmo1脱氧核酶混匀，静置冰上30min。将EP管放入42℃水浴90s，细胞热休克；再将EP管置于冰上2min；然后将EP管置于37℃水浴5min，加0.75ml LB液体培养基于EP管中，37℃ 250r/min振荡培养1h。

    1.9  转化菌生长抑制实验

    将上述转化液各取50μl分别转入100ml含氨苄西林(100μg/ml)LB液体培养基中，37℃振摇培养(180r/min)45min，将温育复苏液涂布到含氨苄西林(100μg/ml)的LB培养基平板上，37℃培养过夜，记数菌落数以初步选择较合适的脱氧核酶剂量。另取12管感受态细胞在冰上融化后，分为3组，每组4管。第一组每管加入30nmo1脱氧核酶，第二组每管加入等摩尔量反义寡核苷酸，第三组每管未经任何处理，操作同前进行转化后，各取转化液50μl分别转入100ml含或不含氨苄西林(100μg/ml)LB液体培养基中，37℃振摇培养(180r/min)，于2、4、6、8、10、12h各取3ml于紫外分光光度计测定A600nm的吸光度值。

    1.10  转化菌粗酶活性测定

    取上述3组转化后1h的菌液0.5ml分别加入100ml含氨苄西林(100μg/ml)LB液体培养基的三角瓶中，37℃振摇(180r/min)5h，紫外分光光度计测定各样本的A600nm的吸光度值，用生理盐水调整使3组12瓶培养液A值相等，再各取50ml调整后的菌液参照方法［1］进行酶初提物的提取并测定粗酶活性。

    1.11  统计学分析

    采用Spss13.0统计分析软件，组与组之间比较采用独立样本的t检验。

    2  结果

    2.1  PCR结果

    产TEM-1型酶菌株PCR产物在相当于900bp区内可见1条DNA带，片段大小与引物设计的扩增片段预计大小基本吻合，大肠埃希菌JM109的结果为阴性。

    2.2  PBK-CMV/TEM-1重组质粒的鉴定结果

    重组质粒经EcoRI和BamHI酶切后产生的片段大小亦约为900bp，与PCR产物大小一致，证明TEM-1型编码基因已正确地接入载体上。测序结果在国际互联网上进行BLAST检索分析，与GenBank中TEM-1(AY302260)编码基因序列的同源性为100%。Nitrocefin显色证实重组菌产β-内酰胺酶。

    2.3  大肠埃希菌的生长情况变化

    导入15、30、45和60nmo1脱氧核酶后的大肠埃希菌在含氨苄西林(100μg/ml)LB平板上细胞存活率分别为81%、64%、63%及61%，均明显低于空白对照(细胞生存率设为1)。导入脱氧核酶的大肠埃希菌在含氨苄西林液体培养基中不同时间点的生长(A值)均明显低于导入反义寡核苷酸或空白对照组(P<0.05)，而在不含氨苄西林的LB液体培养基中不同时间点各组大肠埃希菌的生长无明显差异(P>0.05)，见图1所示。

    2.4  脱氧核酶对大肠埃希菌β-内酰胺酶活性的影响

    导入脱氧核酶5h后的大肠埃希菌β-内酰胺酶粗酶活性明显低于导入反义寡核苷酸或空白对照组大肠埃希菌的粗酶活性(表1)。表1    脱氧核酶对大肠埃希菌β-内酰胺酶活性影响

    3  讨论

    脱氧核酶(deoxyribozyme，DRz)是继核酶之后又一新的分子生物学工具。它是通过对体外合成的随机序列进行筛选获得的、具有对RNA切割功能的DNA分子，其分子量小、易于合成和修饰，在细胞内外的稳定性较高，已经在病毒感染性疾病、肿瘤、心血管疾病等基因中得到了广泛研究［4］，其中“10-23”型脱氧核酶(“10-23” DRz)功能最强。此酶由一个15个核苷酸的催化中心和与靶RNA碱基互补的两个侧翼序列构成，能在靶RNA未配对的嘌呤和配对的嘧啶残基之间发生序列特异性切割效应。目前，DRz应用于抑制细菌耐药基因表达的研究尚处于初步探索阶段［5，6］。

    TEM-1是革兰阴性菌中最常见的β-内酰胺酶［7］。在抗生素选择性压力作用下TEM-1不断突变进化，目前已达150余种亚型。其氨基酸取代位点主要集中在104、164、238、240和276点位上，这些突变对酶主要有两方面的影响：①扩大了催化腔的空间，使具有较大侧链取代基的第三代头孢菌素能够进入而被水解［8］；②提高了对第三代头孢菌素的亲和力［9］。应用RNAstructure4.2软件分析blaTEM-1 mRNA二级结构，其中blaTEM-1 mRNA 379密码子附近的区域相对容易被脱氧核酶接近有利于DRz的切割，并且TEM家族在该区域突变较少，因此该位点对绝大多数TEM家族β-内酰胺酶可能产生效应，是较理想的切割靶点。为了明确菌株背景并避免可能存在的其它家族β-内酰胺酶(如：SHV，OXA等)对实验结果的干扰，我们构建了PBK-CMV/TEM-1重组表达质粒并转化入大肠埃希菌JM109进行实验。

    本实验发现针对blaTEM-1 mRNA分子的脱氧核酶导入细菌体内后，能显著降低β-内酰胺酶的表达。导入脱氧核酶后的大肠埃希菌在含氨苄西林的培养基上不同时间点的生长(A值)均明显低于导入反义寡核苷酸或空白对照组，而在不含氨苄西林的培养基上导入脱氧核酶、反义寡核苷酸及空白对照组大肠埃希菌的不同时间点的生长(A值)无明显差异，表明脱氧核酶及反义寡核苷酸本身对大肠埃希菌细胞生长无抑制作用，脱氧核酶及反义寡核苷酸是通过抑制β-内酰胺酶基因表达使大肠埃希菌在含氨苄西林的培养基上因无法产生足量的β-内酰胺酶来分解培养基中的抗生素，导致细胞存活率降低。反义寡核苷酸由于不具备酶活性，故抑制基因表达能力明显低于脱氧核酶，但在本实验中，细菌的转化效率受到许多因素的影响，脱氧核酶和反义寡核苷酸在相同的转化条件下也很难保证有相同的转化效率，故转化效率可能亦是导致反义寡核苷酸抑制基因表达能力低于脱氧核酶的原因，有待进一步研究。

    目前，脱氧核酶作为一种新型的治疗药物还存在诸多问题，如没有高效的转运系统将其应用于体内实验等。但通过构建脂质体系统或噬菌体表达系统［10］可进一步研究反义药物逆转细菌耐药性，将脱氧核酶为有实用价值的新型抗感染性疾病基因治疗药物。

【】
  ［1］ 李苌清，谢勇恩，凌保东，等. 耐头孢他啶阴沟肠埃希菌Tem-28Vβ-内酰胺酶的特性研究［J］. 抗生素杂志，2005，30(6)：358～361.

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