TolC表达量与大肠埃希菌K-12耐四环素的研究

                       作者：张丹凤 黄传钟 王三英

【摘要】  随着抗生素的开发与使用，细菌在对多种抗生素的适应过程中逐渐出对抗生素耐药的反应机制。TolC是药物排出转运体系的外膜成分，与AcrAB一起形成主要的药物排出泵，有关其表达量与耐药间的关系目前尚不清楚。试验将tolC克隆到pET-32a载体上进行诱导表达，镍柱纯化，免疫新西兰大白兔，获得1∶4000的抗血清。Western blotting分析表明，TolC的表达量在耐四环素的大肠埃希菌K-12中比对照组提高50%。细菌TolC高表达试验发现，其MIC从100μg/ml提高到200μg/ml。结果说明TolC的表达量与四环素耐药性直接相关，提示细菌可以通过调节外膜蛋白的表达实现对抗生素的耐受。

【关键词】  TolC； 耐药性； 大肠埃希菌K-12； 四环素

    ABSTRACT  Association of TolC expression with resistance to tetracycline in Escherichia coli K-12 was studid. TolC was an outer membrane protein, which was bound with AcrAB to form a critical multidrug efflux pump. However, association of TolC amount with drug resistance was ill-defined. In the study, tolC was cloned into pET-32a vector induced expression and its recombinant proteins were purified by Ni-NTA. The purified recombinant proteins were used for preparing of anti-TolC. The prepared antiserum with titer 1∶4000 was utilized as the primary antibody in Western blotting. It showed that TolC amount was increased 50% in tetracycline-resistant E.coli K-12 compared to its original control strain. When TolC was overexpressed, the strain showed strong resistance to tetracycline with its MIC from 100μg/ml to 200μg/ml. These findings indicated that TolC amount was directly correlated to bacterial resistance to tetracycline, suggesting that bacteria mounted an adaptive feedback to antibiotics by regulating outer membrane protein expression.

    KEY WORDS  TolC;  Drug resistance;  E.coli K-12;  Tetracycline

    随着人们对抗生素的过分依赖和滥用，耐药菌株迅猛发展，对人类健康构成严重的威胁。四环素通过与核糖体的30S亚单位结合以抑制细菌蛋白合成［1］而成为广谱抗生素，其抗菌谱包括许多革兰阳性和阴性菌、立克次体、支原体、衣原体、放线菌等。在20世纪50年代，细菌对四环素都非常敏感；1953年Flakow等［2］首次发现痢疾志贺菌S.dysenteriae对四环素产生耐药性。后来又发现志贺菌属Shigella对四环素、氯霉素和链霉素产生了多重耐药性［2～4］。目前认为，细菌耐四环素机制可以分成以下三类：①产生相应的水解及修饰酶以破坏药物活性；②改变药物靶点的结构，使药物无法识别；③阻止药物与靶点接触，其中包括调节膜通透性以及药物排出转运体系的作用，而这两者都与外膜蛋白的作用紧密相关［5］。药物排出转运体系是当前细菌耐药性研究关注的热点，如大肠埃希菌中的AcrAB-TolC系统［6］和铜绿假单胞菌中的MexAB-OprM系统［7］等。药物排出转运体系是对抗生素开发及应用的一个挑战，深入研究其机制将有助于我们发现新的抗菌机制、找到新的靶点。AcrAB-TolC排出系统是大肠埃希菌的主要多重药物外排系统，由内膜转运体AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC组成［6］。Xu等［8］报道，在耐四环素大肠埃希菌K-12中，TolC的表达量上调。Cristobal等［9］发现，大肠埃希菌tolC突变株对四环素的耐药性相对于对照大肠埃希菌下降了5～6倍；当AcrAB转运体系缺失，对四环素的耐药性与tolC突变株一样，MIC值均下降。这些研究表明，AcrAB-TolC排出系统在大肠埃希菌对四环素耐药性中的重要性，目前有关TolC表达量与耐药间的关系尚不清楚。鉴于从蛋白质水平更能直接反映有关生物学意义，本研究探讨TolC在模式菌大肠埃希菌K-12耐四环素中的作用和意义，旨在深入研究AcrAB-TolC药物排出转运系统的作用机制，促进新型抗菌药物的研发。

    1  实验材料与方法

    1.1  菌株及质粒来源

    大肠埃希菌K-12购自院微生物研究所，大肠埃希菌工程菌株为大肠埃希菌DH5α和BL21(DE3)为本实验室保存菌株；质粒载体pET-32a为本实验室保存质粒。

    1.2  tolC的克隆

    tolC的引物根据NCBI上大肠埃希菌K-12的基因组序列设计，并在引物的两端引入酶切位点，P1：5′-CGAGAATTCATGCAAATGAAGAAA-3′；P2：5′-GGTCTCGAGTCAGTTACGGAA-AGGG-3′。PCR扩增后，产物进行胶回收，回收产物与pET-32a质粒均用EcoRI与XhoI进行双酶切、回收、连接和转化，筛选含有目的基因的克隆子。

    1.3  TolC的诱导表达与纯化

    将含有目的基因的克隆子转化大肠埃希菌BL21，对照菌和重组菌分别挑取单菌落接种于3ml含100μg/ml氨苄西林的LB培养基中，于37℃培养至A600约0.5。加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养3h，SDS-PAGE电泳检测。大量接种300ml菌液进行诱导表达，并根据Novagen公司Ni-NTA试剂盒说明书操作步骤进行纯化，洗脱样品于-20℃保存。

    1.4  MALDI-TOF/MS鉴定

    按照Xu等［8］的方法进行样品处理，使用德国Bruker公司的ReFlexTM III MALDI-TOF质谱仪进行分析，反射模式，离子源加速电压1为20kv，加速电压2为23kv，N2激光波长337nm，脉冲宽度为3ns，离子延迟提取2000ns，真空度1.4×10-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，并用标准Maker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，获得肽质量指纹图谱。

    1.5  兔抗血清的制备

    根据Peng等［10］报道的方法免疫新西兰大白兔，采血，摆成最大斜面后在4℃冰箱中静置过夜，使血清析出，分装血清，－80℃保存。用DOT-ELISA方法测定血清的效价。

    1.6  耐四环素大肠埃希菌K12的筛选

    按两倍稀释法［11］测定测定大肠埃希菌K12(原代，C0)对四环素的MIC值(MIC0)，然后在次抑菌浓度条件下(0.5MIC)对大肠埃希菌进行传代培养，每隔12h传代1次，共传代10次，在MH培养基测定其(T10)的MIC值(MIC10)。如果MIC10/MIC0>4，则说明此菌株对该抗生素表现出耐药性。

    1.7  膜蛋白提取

    按照Sabri等［12］的方法提取膜蛋白。挑取单菌落接种于培养基中，振荡培养过夜。以此为种子菌，按1∶50(V/V)的比例接种于另一批培养基中，振荡培养至A600=1.0，6000g收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次。称菌体湿重，按1∶5(W/V)的比例加入超声波破碎缓冲液悬浮菌体，超声破碎，输出功率50%，每次7.1s，间隔9.9s，超声15min。超声破碎后的菌液，12000g，4℃离心15min，收集上清。上清液100000g，4℃离心40min，弃上清，沉淀溶于一定体积超声缓冲液中。样品分装，－80℃保存。

    1.8  Western blotting分析

    按照常规的方法［13］进行SDS-PAGE，电泳结束后，进行电转，恒压50V电转2h，丽春红染色检测电转的效果；加封闭液封闭，4℃孵育过夜；加入一抗，室温孵育1h；取出NC膜，TNT洗膜3次，每次10min；加入酶标二抗，室温孵育1h；取出NC膜，TNT洗膜3次，每次10min；DAB显色。

    1.9  高表达分析

    依1.3步骤诱导tolC-pET-32a/BL21与pET-32a/BL21菌株，并提取它们的膜蛋白，进行SDS-PAGE分析。按两倍稀释法，测定能够大量表达TolC到膜蛋白中的菌株与对照菌株的MIC值。

    2  结果与分析

    2.1  tolC克隆与载体构建

    以大肠埃希菌K-12全基因组DNA为模板，进行PCR扩增，图1第2泳道示PCR扩增得到单一特异条带，而且片段的分子量大小与预计的相当。将tolC重组到pET-32a载体上，挑取重组克隆子，提取质粒并进行双酶切验证。结果表明，阳性克隆子酶切得到的目的片段与以大肠埃希菌K-12菌体作为模板的阳性

    1：分子量标记；  2： tolC的PCR产物；  3～5：重组子双酶切验证

    图1    tolC PCR产物与重组子双酶切验证

    对照大小一致(图1)。

    2.2  TolC的原核表达与纯化

    图2A示pET-32a-tolC重组子经IPTG诱导表达后的全菌蛋白SDS/PAGE分析，可见pET-32a-tolC/BL21经诱导表达后，TolC蛋白加上融合蛋白大小约72.4ku左右，扣除20.2ku的载体融合蛋白，约为52.6ku左右，与预计的分子量相符。进一步用镍柱纯化重组TolC，结果如图2B所示。从图2可见，重组TolC为单一的目的蛋白带，获得的目的蛋白较纯。

    切取目的蛋白带，采用MALDI-TOF进行鉴定。质谱结果如图3及表1所示，证明镍柱纯化的蛋白确为TolC。将其作为抗原，用于兔抗TolC抗血清的制备。结果表明，所制备的兔抗TolC抗血清的效价为1∶4000。

    2.3  四环素耐药菌株膜蛋白提取与Western blotting验证

    大肠埃希菌K-12(C0)对四环素的MIC0值为6.25μg/ml，在次抑菌浓度条件下(1/2 MIC)传代10次，测定其(T10)对四环素的MIC10值为25μg/ml，MIC10/MIC0为4倍，提示T10具有耐药性。

    分别提取了T10和C0两株菌的膜蛋白，Braford法确定两者的上样量均为10μg，以兔抗TolC抗血清为一抗，HRP-羊抗兔为二抗进行Western-blotting分析，结果见图4。图4A为这2种菌株膜蛋白的SDS/PAGE分析，相互间无明显差别；图4B为其膜蛋白的Western blotting分析。该胶上半部分用于Western blotting分析，下半部分采用考马斯亮蓝染色用于加样量对照。由于免疫用的重组TolC蛋白没有切除融合蛋白部分，因此制备的抗TolC抗血清中包括抗TolC和抗融合蛋白2种抗体。为排除由抗融合蛋白导致的非特异性反应，试验分别采用抗TolC抗血清和实验室已有的抗融合蛋白抗血清为一抗进行Western blotting分析。结果发现，只有使用抗TolC抗血清为一抗才能在TolC相应位置检出阳性带，且T10的TolC表达量明显高于C0。图4C为图4B以C0对照组为100%标化后的结果。这些结果说明，TolC在大肠埃希菌K-12耐受四环素过程中起到重要的作用。

    2.4  TolC高表达与细菌耐四环素的关系

    为进一步探讨TolC表达量与耐药的关系，试验构建了tolC-pET-32a表达质粒，并以pET-32a作对照，分别在E.coli BL21中表达。为了证明重组TolC已在细胞膜上得到大量表达，我们提取了膜蛋白进行验证。图5A示两者膜蛋白的SDS/PAGE分析图谱，可见相互间具有明显差异。采用抗TolC和抗融合蛋白2种抗血清进行Western blotting试验发现，试验组出现了2条显色带，分别与天然TolC和重组TolC的分子量一致(图5B)；对照组出现2条带，其分子量分别与重组TolC和融合蛋白一致(图5C)。这些结果与我们所使用的2种抗血清和被检测对象的特点具有一致性，说明重组TolC确实在试验组细胞膜上得到高表达。

    按照1.6的方法测定这2株菌株对四环素的MIC值，结果如表2。从表2可见，tolC-pET-32a/BL21的MIC值为200μg/ml，pET-32a/BL21的MIC值为100μg/ml，前者是后者的2倍。

    3  讨论

    抗生素的生产与伴随着细菌耐药性的不断发展，一种新的抗生素投入使用后，很快就发现有相应的耐药菌株出现。在细菌中普遍存在的抗药性是对抗菌药物的生产开发及对细菌性疾病防治的一个巨大挑战，对细菌耐药机制的深入研究是解决这一难题的关键。现己经证实，细菌阻止药物与靶位点接触主要通过外膜蛋白对膜通透性的调节以及药物排出转运体系的作用来实现［5］。根据作用对象的范围，可以将药物排出转运体系划分为特异性排出转运体系和多种药物排出转运体系这两大类，后者与现在广泛存在多重耐药菌株有着紧密的关系。不管是特异性还是多药物排出转运体系，外膜蛋白都在其中起到重要的作用。

    大肠埃希菌AcrAB-TolC药物排出转运体系中，TolC由495个氨基酸组成，经质谱鉴定分子量为53.3ku。Woronakis等［14］报道，TolC为三聚体，上端空间为β折叠，形成开放结构，以便给外排药物提供泵出宽阔通道；下端空间为α螺旋，α螺旋部分进入周质与融合蛋白AcrA连接；当内膜转运蛋白AcrB捕获到细胞内的抗生素并与之结合时，TolC与AcrAB复合体连接，打开内在通道，将抗生素排出。因此，我们对TolC基因进行克隆，并进行Western blotting分析，显示TolC在耐四环素大肠埃希菌中表达量为上升。上述结果说明TolC表达上调时可以增加细菌对四环素的外排速度，产生耐药。为了进一步验证TolC的功能我们对TolC进行了高表达分析。试验结果表明，当TolC大量表达到膜蛋白上，tolC-pET-32a/BL21对四环素的耐受由对照的100μg/ml上升到200μg/ml，即TolC大量表达可以提高细菌对四环素的耐受能力，同进也说明大肠埃希菌耐药的产生与AcrAB-TolC系统的功能加强明显相关。我们的结果从蛋白质水平证明了TolC在耐四环素中的重要作用。

【】
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