天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中dnrX基因的敲除及多柔比星产生菌的构建

                    作者：宫倩 尚珂 胡又佳 朱春宝 朱宝泉

【摘要】  柔红霉素是合成重要抗肿瘤抗生素多柔比星的前体，由微生物发酵产生。通过PCR从国内柔红霉素生产菌种天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA中扩增出约1080bp的dnrX部分序列，将PCR扩增片段中985bp的片段亚克隆至大肠埃希菌质粒pYG813构建了同源重组突变质粒pYG963，转化SIPI-1482原生质体并成功地敲除了dnrX基因，得到一株稳定的突变株。该突变株的发酵试验表明dnrX基因所编码的酶的功能已经被有效地阻断，对酸敏感的副产物减少，柔红霉素的产量增加了近3倍，将原野生菌改造成为多柔比星产生菌，发酵效价与原野生菌株柔红霉素的发酵效价相当，为直接发酵法生产多柔比星打下了基础。

【关键词】  dnrX基因； 多柔比星； 柔红霉素； 同源重组； SIPI-1482

    ABSTRACT  Daunorubicin (DNRB) and doxorubicin (DXRB), two important anthracyclines in clinics, were first-line chemotherapeutic agents in the treatment of various neoplasmias and myelogenous leukemia. Doxorubicin, the C-14 hydroxylated derivative of daunorubicin, showed a broader spectrum of anti-tumor activities, lower toxicity and fewer side-effects compared with daunorubicin. To date, daunorubicin and doxorubicin were industrially produced by Streptomyces fermentation and chemical semi-synthesis, respectively. A partial dnrX gene fragment in length of 1080bp was amplifyied by PCR from the genomic DNA of Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482, the domestic daunorubicin-producer. Sequence alignment indicated that this fragment had a 94.8% homology with the published dnrX gene from S.peucetius ATCC 29050, and further subcloned into an E.coli vector pYG813 to construct the disruption plasmid pYG963. After demethylation and alkaline denaturation, pYG963 was transformed into SIPI-1482 by homologous recombination and the disruption of gene dnrX in SIPI-1482 was validated by PCR. It was found that inactivation of DnrX could decrease the amount of some acid-sensitive substance and increase the yield of daunorubicin by 3 folds. Doxorubicin, which could not be produced by SIPI-1482, could be detected in the metabolites of this disruptant SIPI-1482-Q1. The yield of doxorubicin, whose molecular weight was confirmed by mass spectrum, was higher than 10μg/ml, which was comparable to daunorubicin production in wild-type SIPI-1482. SIPI-1482-Q1 was stable in both genetic and production level, and this makes it possible for direct fermentation of doxorubicin.

    KEY WORDS  dnrX;  Doxorubicin;  Daunorubicin;  Homologous recombination;  SIPI-1482

     柔红霉素(daunorubicin，DNRB)和多柔比星(doxorubicin，DXRB)是重要的蒽环类抗生素，主要用于多种实体瘤和急性白血病的，是临床上抗肿瘤的一线药物。在柔红霉素和多柔比星的生物合成中，dnrX基因位于上游推测的聚酮生物合成酶基因dpsY和下游自身抗性基因drrD之间［1］，其编码的蛋白DnrX的具体功能尚不完全清楚，但会将DNRB和DXRB进一步代谢生成未知的产物，而这些产物中的一部分经过酸化会重新水解成这两种产物。有研究指出对国外柔红霉素产生菌波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC 29050中dnrX基因的阻断突变可导致DXRB产量增加3倍［1，2］。本文根据S.peucetius ATCC29050的dnrX基因的序列(GenBank登录号：AF048833)设计了PCR扩增引物，从本实验室保存的国内柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482中扩增出1080bp的dnrX基因部分序列，并构建了单交换的阻断突变质粒。用同源重组的方法阻断了dnrX基因并通过发酵实验考察了突变株产柔红霉素和多柔比星的能力。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  菌种、质粒和培养基  E. coli DH5α、E.coli JM110，S.coeruleorubidus SIPI-1482由本实验室保存。pUCm-T购自上海生工生物工程公司，pYG813为实验室构建的将安普霉素抗性基因(apr，GenBank登录号：AJ566337)克隆至pUC18的重组质粒。大肠埃希菌用LB培养基［3］，各种链霉菌菌体培养用YEME培养基，链霉菌原生质体转化用R2YE培养基［4］，SIPI-1482种子及发酵培养基见［5］。

    1.1.2  引物的设计合成

    扩增dnrX基因  dnrX1：5′-GGCCGCCAGCCG-CTGTCCGA-3′；dnrX2：5′-GTGGTTCCAGGCGAA-GAGCAGCGCATAGTC-3′。

    扩增安普霉素抗性基因  apr1：5′-GATGCAGG-AAGATCAACG-3′；apr2：5′-AGGTCTGGACGAC-GAGC-3′。

    引物由上海华大生物工程公司合成。

    1.2  实验方法

    1.2.1  基本操作  DNA酶切、电泳、连接、转化大肠埃希菌等均参照文献［3］。天蓝淡红链霉菌SIPI-1482 DNA操作、链霉菌原生质体制备、转化均参照文献［3，4］。

    1.2.2  PCR扩增  PCR扩增dnrX基因条件为：97℃预变性5min，95℃变性0.5min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环30次，最后于72℃延伸10min。PCR扩增抗性基因apr退火温度为57℃，延伸时间为1min，其余条件同上。

    1.2.3  阻断突变质粒pYG963的构建  将扩增dnrX基因的PCR产物回收后直接与pUCm-T连接，转化DH5α感受态细胞，构建质粒pYG957。pYG957用NcoI单酶切，大片段自身连接，转化DH5α感受态细胞，构建中间质粒pYG962。pYG962用KpnI和HindIII双酶切的1088bp片段与pYG813用KpnI和HindIII双酶切的大片段连接，转化DH5α感受态细胞，构建阻断突变质粒pYG963。

    1.2.4  转化链霉菌的质粒DNA预处理  用DH5α中构建的质粒pYG963转化E.coli JM110，进行去甲基化修饰，提取其中质粒用适量的TE缓冲液溶解。取10μl质粒DNA加水稀释至100μl，加入等体积0.4mol/L的NaOH溶液，37℃保温10min，碱变性单链化。冰浴1min。加入1/10体积的pH4.8的3mol/L的NaAc溶液和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置20min。离心弃上清，沉淀用适量70%乙醇洗涤，回收DNA用适量TE缓冲液溶解，用于原生质体转化。

    1.2.5  阻断突变株发酵和产物提取  30μg/ml的安普霉素抗性平板上挑选白色重组子接种不含抗生素的种子培养基，30℃培养2d，转接不含抗生素的发酵培养基继续培养5d。同一瓶发酵液分别取相同体积的两份，其中一份用饱和草酸溶液调pH至1.5，50℃水浴酸化1h，然后用NaOH溶液调pH至8.5，等体积氯仿萃取，有机相浓缩至干，后用甲醇溶解得待测样品。另一份样品不经酸化直接用NaOH溶液调pH至8.5，其余步骤相同。HPLC检测产物的产量。

    1.2.6  HPLC分析  色谱柱：大连依利特公司Hypersil 2ODS(4.6mm×250nm，5μm)。流动相：甲醇∶水∶乙酸∶三乙胺(56∶44∶2.5∶0.5)。样品用孔径0.22μm的偏氟膜过滤。流速1ml/min，检测波长254nm，柱温35℃。

    2  结果

    2.1  dnrX基因的PCR扩增和序列同源性比对

    按照1.2.2 PCR扩增条件，以dnrX1和dnrX2为引物从天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA中扩增出约1.1kb大小的片段，和预计扩增的目的片段大小相近(Fig.1)。

    将PCR扩增产物进行亚克隆并交英骏公司测序，测序结果与GenBank中S.peucetius ATCC29050来源的dnrX基因进行序列比对(采用Informax公司Vector NTI软件)。以1.1.2所示引物只扩增得到          1: SIPI-1482 genomic DNA as template;

    M: DL2000 marker (Takara)

    Fig.1    PCR amplification of dnrX gene from SIPI-1482

    genomic DNA

    1080bp的片段(dnrX′)，是dnrX基因的部分序列，S.peucetius ATCC29050中dnrX基因的相应片段与该PCR产物的序列同源性为94.8%，距离起始密码和终止密码各63和69bp。

    2.2  相关质粒及其验证

    按1.2.3方法所述构建用于同源重组单交换质粒pYG963(Fig.2，含有dnrX′片段通过NcoI酶切去掉5′端95个碱基的dnrX"及安普霉素抗性基因用于筛选)并经PCR和酶切验证通过。按照方法1.2.4对转化用DNA进行预处理并转化SIPI-1482原生质体进行同源重组，同源交换臂长度为985bp，发生重组后经过单交换完整质粒整合到染色体上(Fig.3)，使原来的dnrX基因部分缺失从而丧失了DnrX蛋白的功能。同时单交换使工程菌具有了安普霉素抗性，通过安普霉素抗性筛选转化子，得到dnrX基因的阻断突变株命名为SIPI-1482-Q1。

    2.3  重组子的PCR验证

    按照与SIPI-1482相同的方法培养重组子并提取基因组DNA进行PCR验证。Fig.3的单交换示意图，以dnrX1和apr1为引物，只有重组子基因组DNA的模板能够扩增到dnrX′基因(1080bp)加抗性基因apr约1931bp的片段，而质粒pYG963(dnrX1无法匹配)和SIPI-1482基因组DNA(apr1无法匹配)都不能扩增到。以apr1和apr2引物能从重组子基因组DNA和质粒pYG963中扩增到抗性基因apr，但SIPI-1482则没有。另外以dnrX1和dnrX2为引物能从重组子基因组DNA模板中扩增出1080bp的dnrX，而以质粒pYG963为模板不能扩增到(Fig.4)。这些结果均表明发生了正确的同源重组，同时也避免了质粒DNA或者交换脱落的DNA对仅使用抗性基因或dnrX基因PCR结果的干扰，证实Q1重组菌的dnrX基因已受到破坏并整合了apr基因。

    2.4  重组子发酵实验结果

    重组子和SIPI-1482野生菌株分别在不含抗生素的培养基中发酵，按照方法1.2.5所述处理样品，HPLC检测发酵产物(Fig.5)。重组子与野生菌相比，柔红霉素的产量从9.4μg/ml提高到30.1μg/ml，提高了3倍，而更大的区别在于原来的出发菌株SIPI-1482仅发酵产柔红霉素，并不象国外的S.peucetics还能检测到多柔比星，而重组子发酵结果表明它已经能够产生多柔比星，发酵效价为10.9μg/ml(Fig.6)。HPLC中多柔比星的峰经质谱验证符合多柔比星的分子量。

    2.5  重组子稳定性

    将重组子在不含抗生素Apr的G1斜面上传代，每一代斜面孢子分别接种含抗生素Apr 30μg/ml的斜面，仍然能够正常生长，孢子形态没有变化。将每一代斜面孢子进行发酵实验，结果见Fig.7。其中F2柔红霉素和多柔比星的产量较高，F3、F4和F5柔红霉素和多柔比星产量比较稳定，没有显著差异。F0和F1柔红霉素产量偏低，可能与斜面保存时间较长有关。总之，重组子经过在不含抗生素Apr的G1斜面上连续传代6代以后，产抗能力没有明显下降，说明该重组子比较稳定。而且传代后仍然具有安普霉素抗性也说明了重组子遗传上的稳定性。

    3  讨论

    GenBank中只报道了一种dnrX基因序列，起初我们欲根据该序列设计引物从SIPI-1482基因组DNA中扩增dnrX的全长序列，但未获成功。随后通过比较GenBank中相似基因的序列，并选取同源性最高的区域来设计引物成功地扩增到1080bp的部分序列，虽然接着尝试反向PCR的方法也未能得到全长序列，但利用这1080bp的部分序列已经可以进行基因阻断的操作了。根据S.peucetius ATCC29050中dnrX基因的相应片段与该PCR产物的序列同源性为94.8%来判断，可能在dnrX基因的起始位置或终止处有较大的差异导致扩增未能成功。而重组子基因组DNA中dnrX基因缺失少数碱基(可能是N端69bp)造成dnrX基因的不完整，从发酵结果可以看出dnrX基因的阻断对发酵结果有很大影响，这可能是由于该酶的功能已经完全或者部分丧失，说明缺失的部分可能是酶作用的必须区域。

    对于能否发生同源重组，交换臂的长度是关键因素。不同菌株要求的交换臂最小长度不同，例如天蓝色链霉菌中800bp的同源交换臂就能够发生同源交换，而灰色链霉菌要求交换臂长度至少为2kb。Scotti等以411bp的交换臂进行同源重组，成功地在波赛链霉菌中阻断了dnrH基因［6］。有过报道在天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中470bp的交换臂能有效地发生同源重组［7］，但在本研究工作中曾构建交换臂分别为499和584bp的单交换质粒和交换臂分别为424和652bp的双交换质粒，用相同方法转化却未得到正确的重组子，而以985bp的交换臂则成功地进行了同源重组，说明欲得到正确的同源重组子，除了要满足最小长度的交换臂以外，还涉及到其他因素。

    柔红霉素和多柔比星作为广谱抗肿瘤抗生素化学结构类似，作用机制也相同。然而与柔红霉素相比，多柔比星相同剂量的疗效更强，抗肿瘤谱也更广，毒副作用更低，且无交叉耐药，这使其具有更高的应用价值。目前上生产多柔比星主要应用化学半合成法，从柔红霉素出发经过七步反应获得多柔比星，总收率从柔红霉素算起最高为40%，在生产中一般为33%左右。化学合成法存在很多缺点，特别是需要消耗大量有机溶剂，不仅造成生产成本提高，还引起了环境污染。如果能通过分子生物学方法改造柔红霉素产生菌为直接发酵生产多柔比星就可以有效解决以上问题。

    Silvia等通过插入新霉素/卡那霉素抗性基因aphII，阻断柔红霉素产生菌S.peucetius ATCC29050中的dnrX基因。工程菌发酵实验表明两种未知的对酸敏感的鲍霉素类似物浓度降低，柔红霉素和多柔比星的产量提高，其中多柔比星产量提高近3倍。进一步的dnrX基因补偿试验证明以上变化均是dnrX基因的阻断突变的结果［2］。

    在我们的实验中发现野生型SIPI-1482未经酸化的样品中几乎检测不到柔红霉素，而重组子样品不经酸化即有大量柔红霉素产生，酸化处理使重组子柔红霉素和多柔比星的产量降低，并在HPLC检测中各出现一个杂峰，可能是多柔比星和柔红霉素酸化分解的产物，也间接说明阻断dnrX基因的同时阻止了鲍霉素类似物的产生。

    国内柔红霉素生产菌种SIPI-1482与S.peucetius ATCC29050和Streptomyces.sp c5同属于柔红霉素产生菌，具有相似的生物合成基因，从理论上讲应该具有产多柔比星的能力，但是采用［5］所述培养基发酵都不能检测到多柔比星，而在dnrX基因被阻断的重组子SIPI-1482-Q1的发酵产物中检测到了多柔比星的产生，并且产量与野生菌株的柔红霉素产量相当。而传代实验也证明该重组菌遗传学及产量上比较稳定。

    另外从提高柔红霉素和多柔比星产量角度考虑，对S.peucetius ATCC29050的dnrX和dnrU(酮基还原酶基因)同时阻断的双突变株多柔比星产量可高达94μg/ml，是dnrX或dnrU单突变株的2倍。而dnrX/dnrU/dnrH三突变株多柔比星的产量是双突变株的3.4和3.8倍［8］。因此，进一步尝试对SIPI-1482中dnrX与dnrU和dnrH同时阻断，有望能进一步提高柔红霉素和多柔比星产量，为直接发酵法生产多柔比星打下基础。

【文献】
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［2］ Filippini S, Lomovskaya N, Fonstein L, et al. Process for preparing daunorubicin and doxorubicin ［P］. US5989869,1999-11-23.

［3］ 萨姆布鲁克J, 弗里奇EF, 曼尼阿蒂斯T等. 分子克隆实验指南(第二版)［M］. 北京：出版社，1992：16.

［4］ Hopwood D A, Bibb M, Chater K F, et al. Genetic manipulation of Streptomyces: A laboratory manual ［M］. Norwich: John Innes Foundation,1985:69.

［5］ 蒋世春，吴建平，白骅. 应用等离子体辐射技术选育柔红霉素产生菌——天蓝淡红链霉菌［J］. 辐射研究与辐射工艺学报，2001，19(2)：133～137.

［6］ Scotti C, Hutchinson C R. Enhanced antibiotic production by manipulation of the Streptomyces peucetius dnrH and dnmT genes involved in doxorubicin (adriamycin) biosynthesis ［J］. J Bacteriol,1996,178(24):7316～7321.

［7］ 尚珂,谢丽萍,胡又佳，等. 柔红霉素产生菌Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482中dnmV基因的克隆及阻断［J］. 医药工业杂志，2006，37(5)：307～310.

［8］ Lomovskaya N, Otten SL, Doi-Katayama Y, et al. Doxorubicin overproduction in Streptomyces peucetius: cloning and characterization of the dnrU ketoreductase and dnrV genes and the doxA cytochrome P-450 hydroxylase gene ［J］. Bacteriol,1999,181(1):305～318.