氢化可的松的合成研究进展

                     作者：贾春燕 陈建新 尹秋响 王静康

【摘要】  氢化可的松是哺乳动物主要的肾上腺皮质激素类药物和重要的甾体药物合成的中间体。本文简要综述了其全化学合成、半合成法及全生物合成方法、路径的国内、外现状及相关进展情况，并对其方向进行了评述和展望。

【关键词】  氢化可的松； 甾体药物； 化学合成； 半合成法； 生物合成

    ABSTRACT  Hydrocortisone is the major glucocorticoid and an important intermediate in steroid drug synthesis. The main synthetic approaches and progresses including total chemical synthesis, semi-synthesis and whole-cell bioconversion for hydrocortisone manufacture in domestic and other countries were briefly reviewed. Prospective and evaluation of hydrocortisone synthesis were also discussed.

    KEY WORDS  Hydrocortisone;  Steroid agents;  Chemical synthesis;  Semi-synthesis; biosynthesis

    氢化可的松(hydrocortisone，HC)的化学名称为11β，17α，21-三羟基孕甾-4-烯-3，20-二酮，属肾上腺皮质激素类药，是激素类药物中产量最大的品种，其结构式如图1所示。目前、英、美、日、法等国及欧洲药典均有收载。5体HC是哺乳动物肾上腺皮质分泌的主要糖皮质激素，其药理作用是通过弥散作用于靶细胞，与其受体相结合，形成类固醇-受体复合物，激活的类固醇-受体复合物作为基因转录的激活因子，以二聚体的形式与DNA上的特异性顺序链结合，调控基因转录， 增加mRNA的生成， 并以此为模板合成相应的

    图1    氢化可的松结构示意图蛋白，这些蛋白在靶标细胞内实现类固醇激素的生理和药理效应;HC能影响糖代谢，具有抗炎、抗病毒、抗休克和抗过敏等作用。主要用于肾上腺皮质功能减退症的替代及先天性肾上腺皮质功能增生症的治疗，也可用于类风湿性关节炎、风湿性发热、痛风、支气管哮喘、过敏性疾病，并可用于严重感染和抗休克治疗等［1～4］。HC也是制备其他几种重要甾体药物的原料药。1948年，美国风湿病专家Hench在风湿病关节炎的治疗中发现可的松在体内转化HC才具有疗效。因发现可的松和HC的药理作用，Hench、Reichstein和Kendal一起获得了1950年的诺贝尔奖，并从此掀起了开发皮质激素的高潮。Wendler等用化学法合成了HC，但由于步骤多、收率低，导致药品价格昂贵而难以化。此后，人们开始把目光转向生物转化方法。Fieser首先采用微生物转化方法使HC工业化生产成为可能［5］。为提高转化率和收率，国内外研究人员做出了不懈努力，并取得较大进展。

     1  化学合成法制HC

    Woodward报道的HC全化学合成法近40步合成步骤［6］，以4-甲氧基-2-甲基苯醌作起始原料，经20步合成了第一个全合成的非芳香类固醇dl-Δ9(11)，16-双脱氢-20-去甲孕酮，后转化成甲基dl-3-酮-Δ4，9(11)，16-三烯胆酸，甾体骨架中A、C和D环具有对应的活性位，三重不饱和醚可全加氢和氧化成甲基三酮别胆烷，然后用三价的铬酸对11位氧化，经一系列转化得HC。但向C11-氧代氢化茚满的C-17位引入HC侧链是很困难的。烯基溴化镁可在C-11β位具有高的立体选择性［7］。报道的18步合成可的松［8］，该方法由环己烯衍生物开始经11步反应合成17-异丙烯基茚满酮，再据Stork方法经7步反应合成可的松，Oliveto将HC醋酸酯转化成它的3，20-二肟，二腙和缩二氨基脲，再通过钾硼氢，硝酸作用脱去缩氨基脲得HC［9］。Minagawa等［10］向2，3-二氢茚中间体同时引进11-氧代基团和可的松侧链，可使合成步骤大大缩短，但化学合成法步骤多，总收率低。

    2  半合成法制HC

    2.1  HC半合成法简介

    因全化学法合成HC价格昂贵，目前生产几乎都采用含甾体母核的生物质作原料的半合成法。甾体药物半合成法的起始原料都是甾醇的衍生物，如从薯芋科植物穿地龙、黄姜、黄独等植物根茎萃取的薯芋皂素；从丝竺属植物剑麻萃取的剑麻皂素等。比较薯芋皂素(图2)与HC(图1)的化学结构可知，必须去掉薯芋皂素中的E、F环。薯芋皂素经开环裂解去掉E、F环后，即能获得理想的HC关键中间体——双烯醇酮醋酸酯。在此过程中，除将C3羟基转化为酮基，C5、C6双键位移至C4、C5位外，还需要引入三个特定的羟基。这些羟基的转化和引入，有的较易进行，如C3的羟基经氧化可直接得到酮基，与此同时还伴有△5双键的转位。C21位上有活性氢原子，可通过卤代之后，再转化为羟基；利用双键的存在，可经过氧化反应转化为C17羟基，并且由于X环的立体效应使C17羟基恰好为α-构型。在HC半合成路线中，关键一步是C-11β羟基的引入。由于在C-11位周围没有活性功能基团的影响，常规化学法很难氧化非活泼碳氢键，而生物催化法却能对它立体选择性氧化。有效的菌种是黑根霉和犁头霉。前者可专一性的在C-11位引入α-羟基，引入构型恰恰相反，故还需将其氧化为酮得醋酸可的松，再用钾硼氢对其进行不对称还原，得C-11位β-羟基物，即HC；犁头霉却能在化合物S的C-11位上直接引入β-羟基，后者就缩短了合成HC的工艺路线［11］。图2    薯芋皂素结构示意图

    这两种合成方法都是以薯芋皂素为起始原料，经双烯醇酮酸酯环氧化后，再经Oppenauer氧化得环氧黄体酮。区别是在由环氧黄体酮出发后的不同合成路径。梨头霉法是由环氧黄体酮先上溴开环、氢解除溴上碘置换得醋酸化合物，再经梨头霉氧化直接引入C11位上β-OH得HC。黑根霉法是先在C11位上引入-OH后，经用铬酐铬酸氧化C11位α-OH为酮基，再上溴开环，用Raney镍氢消除溴，上碘置换得醋酸可的松，而后以缩氨脲保护C11、C20位上的酮基，用钾硼氢还原C11位上酮基使成为β-OH，脱去C11、C20位上的保护基和水解C21位上的乙酰基后得到HC。

    梨头霉能在去氧氢化可的松(R5)C11位直接引入β-OH，缩短了合成HC的工艺路线。目前国内生产HC的菌种主要是蓝色犁头霉，但由于蓝色犁头霉氧化专一性低，HC的收率受到限制。国外大都是用新月弯孢霉进行工业化生产，国内对用新月弯孢霉进行生物转化生产HC也有相关研究，但工业化生产较少。一般说来，新月弯孢霉对底物去氧氢化可的松醋酸酯(RSA)具有较低的脱乙酰活性，而犁头霉AS3．65却对RSA呈现较高的脱乙酰活性。

    生物转化法大大简化了HC的合成路径，成本也大幅度降低。为提高转化率和收率，研究人员做出了重大努力，取得了较大进展。

    半合成方法中其它不同中间原料的主要合成途径见图3［10，12～17］。上述五种合成方法中以D方法最为简洁，但新月弯孢霉的转化率不高。如果以乙酸化合物为底物经新月弯孢霉转化，虽可在C11-β位引入-OH得到HC，但同时会产生14α-OH副产物。如果改用17α-乙酸化合物为底物，其立体阻碍效应可抑制14α-OH副产物的产生，HC产率可提高到70%左右。德国Schering公司将将乙酸化合物乙酰化得3β，17α，21-三乙酸酯化合物，经黄杆菌转化得17α-乙酸化合物，再经新月弯孢霉转化得11β-OH化合物S-17α-乙酸酯，将其溶解于甲醇，加NaOH使17α-乙酸酯水解即得HC，产率70%［18］，过程如图4所示。

    2.2  提高HC半合成收率及转化率的途径

    国内利用微生物进行生物转化生产甾体药物，可将微生物胞内酶引入反应体系，利用微生物全细胞对底物进行生物转化。而在实际生产中，甾体化合物在水溶液中溶解度很低，一般溶解度范围在10-5～10-6mol/L，而微生物体内的11β-羟化酶位于水相中，又是一种胞内酶，底物需要透过细胞膜进入细胞才能进行转化反应，甾体底物与生物酶的接触十分困难。而利用“变压生物转化技术”［19］，根据微生物本身特性，通过在生物反应的一定阶段施加温和压力，以破坏底物RSA晶体结构，显著改善其在水相中的溶解性，增加生产菌株的细胞膜通透性，可促进底物与胞内酶的结合，使蓝色犁头霉HC转化率提高15%。

    杨顺楷等［20］采用超声法制备底物去氧氢化可的松(RS)-β-环糊精包合物，可提高甾体生物转化的底物投料浓度50%。若采用连续两批次生物转化生产HC，也可提高底物浓度和HC的转化率。以新月弯孢霉的Ⅱ级培养18h的活菌丝为C11β位羟化催化剂［21］，结合液相提取及菌丝淘析处理的方法，该工艺底物转化率可维持在65%以上，HC的收率可达60%。此外可分离回收未转化的高价值的甾体底物RS。

    蓝色犁头霉的二级发酵培养工艺，分离出菌丝物在液相悬浮介质中对RS底物进行C11β-羟基化，在底物浓度相同的情况下，与直接发酵氧化(一步转化法)比较，氧化(C11β-羟基化)速度提高1～2倍，缩短了发酵周期；RS的投料浓度也比直接发酵氧化提高了1.2～1.3倍，间接提高了转化率［20，22］。

    对于微生物转化合成HC的方法，为了提高产率和转化率，国内、外都进行了不懈的努力。发展药物合成中一步分离的发酵工艺可使整个工艺简化。从RS开始合成去氢HC，需要连续两步微生物转化反应。若对每步反应的产物进行提取、分离，势必造成人力、物力和时间的浪费。若：①采用两种微生物分别培养后转化，Mazumder［23］成功地采用两种不同的固定化微生物，连续转化RS得到了去氢HC；②两种微生物分别培养后混合转化，Shull用培养好的草分枝杆菌(Mycobaccerium phlei)菌液稀释新月弯孢霉混合，经一步转化使RS变成去氢HC；③两种微生物混合培养与转化也能使整个工艺简化［24］。另外药物合成需要与反应器设计、分离纯化、过程强化等化学工程技术更加紧密地合作才能取得更大的效果。

    2.3  减少副产物产生的方法

    减少副产物的生成也是提高HC转化率的重要方面。HC黑根霉和犁头霉半合成工艺中最大的副产物是表氢化可的松，即C11α-羟基化合物。它是没有生理活性的副产物。对合成甾体糖皮质激素来说，由于11β-OH是抗炎药物必须的基团，最重要的微生物转化是羟化反应。Hayano将C-11-α和C-12-α位的氢用3H所取代的孕甾-3，20-二酮作为底物，用黑根霉进行羟化来进行研究，说明甾体的酶促羟化反应是羟基位置上的氢被直接取代，即羟基取代的立体构型是由氢原子原来所占的空间位置决定的。11-β-羟化其上羟基的立体位置是竖直的，由于10，13角甲基的存在，11-β-竖键羟基的立体阻碍比11-α-横键羟基位阻为大，造成11-β-羟化比11-α-羟化收率低，且副产物较多。表氢可的松可转化为可的松或其它甾体，如氟氢可的松等加以利用，以减少原料的浪费。

    王敏等［25］通过采用细胞通透剂二甲基亚砜和丙二醇来提高HC转化的立体选择性，其中二甲基亚砜能使β/α值提高5%，丙二醇能使β/α值提高9%。他们在开展犁头霉对RSA的羟基化研究中，选择洗涤菌丝悬浮在柠檬酸缓冲液中有利于C11β-羟基化，指出无论是犁头霉或新月弯孢霉在C11β-羟基化反应中，洗涤菌丝可提高羟化酶的专一性，减少异构体副产物的形成［26］。

    波兰学者Sedlaczek等在新月弯孢霉对RS的C11β-羟基化过程消除副产物方面取得了引人注目的进展［27］。通过理性了解真菌的系统生物学知识，借助传统的诱变选育技术，对新月弯孢霉菌丝细胞的原生质体(有完整核型)用化学诱变剂NTG处理，分离选育出对甾体RS的C11β-羟基化稳定型的突变株，可显著降低副产物量的65%，获得产率较亲株高28.5%。

    Modilnisky等在开展蓝色犁头霉(TieghemeUa orchidis)对RSA生物转化生产HC的实验研究中，将培养基中的葡萄糖用蔗糖或淀粉替代，结果并没有造成C11α-和C11β-羟化甾体产物数量比例的改变，但却呈现了利用蔗糖作碳源的试验组转化速度较淀粉组快1.5倍，较利用葡萄糖组快2倍的试验结果。放大试验中，在不超过10～14h转化期间内，生成产物HC的数量比例达到55%～60%。值得指出的是该RSA的底物质量浓度较低(0.5g/L)，实际应用价值有限［28］。

    若以RS-17α，21-二醋酸酯为底物代替常规的去氧氢化可的松醋酸酯(RSA)，实验转化结果中副产物14α-羟基-RS的生成量明显减少［29］。这是因为在甾体分子C14-位附近的α面当引入较大的取代基，如17α醋酸酯，可造成14α-位的立体障碍，抑制14α-羟基化活性，提高11β-羟基化物的收率。荷兰Gist公司采用化合物RS-17α-醋酸酯为底物，获得了高收率的HC及HC17α-醋酸酯的混合物，后者易水解为HC。

    3  全生物合成HC

    动物体内能合成三类重要的类固醇：糖皮质激素(如HC)、盐皮质激素和性激素。在动物肾上腺皮质内，由线粒体侧链分裂胆固醇，使之转化成孕烯醇酮，在内质网(sER)和线粒体中脱氢成黄体酮，再经过细胞色素P450酶的17α羟化、皮质脱氧、11β羟化三步酶促反应，最终在线粒体中转化为HC；也可用植物Δ7还原酶修饰麦角固醇主体利用简单碳源转化成孕烯醇酮(图5)［30］。

    Dumas等报道，酵母本身并不合成胆固醇，也不从外界吸收固醇类。它需要以简单的含碳化合物，如乙醇和葡萄糖为原料，通过△7还原酶合成类似于胆固醇的物质，麦角固醇，然后模仿肾上腺合成HC［31］。这需要在酵母体内重新组建人体合成HC的整个途径，也就是将合成途径中所需的全部基因引入酵母体内，而酵母体内存在的对合成目标产物不利的基因也将被

    图5    HC生物合成(A)在肾上腺皮质中，(B)在重

    组酵母体系中。黑框表示在线粒体中反应，灰框表示在内质网细胞质表面反应①细胞色素P450侧链分裂酶；②P450 17α羟化酶；③3β-羟基脱氢异构酶；④P450 21-羟化酶；⑤P450 11β-羟化酶；⑥Δ7还原酶除去［32］。

    酵母合成HC是在一种高专一化的酶，即细胞色素P450单(加)氧酶催化下进行的。细胞色素P450系列酶是一个亚铁血红素蛋白大家族，主要应用在药物代谢和类固醇、油脂、维生素及天然产品的合成中。他们在不活泼C-H键中插入氧原子方面有显著作用，但他们的应用受限于底物的敏感性、低活性、不稳定性及需要辅因子。人们通过不同的途径，如变异、化学修饰、条件工程及固定化希望有效攻破这些难题［33］。

    2003年，法国、德国学者和界合作［31］，首次全生物合成了HC。该重组人源化酵母工程设计制备13个工程基因并表达在单个酵母体中，其中9个基因由外源机体哺乳动物及植物提供。构建成功的这一酵母工程菌，它能表达1个植物酶基因，引入8个相关哺乳蛋白酶，需优化两个线粒体系统，敲除4个产生副反应基因，使得原本仅产生麦角甾醇的酵母菌能利用简单碳源乙醇，糖等制得HC。这项研究成功解决了①CYP11A1底物的自生产；②线粒体P450及相关载体的靶目标；③人工生物合成的新陈代谢平衡；④将中间产物转化为代谢终产物的副反应的识别和防止；⑤对酵母有毒害作用的中间产物识别等难题。识别出两个主要的副反应是：由ATF2的基因产物催化的孕烯醇酮的酯化和由GCY1和YPR1基因产物共同催化的17α-羟基孕酮的20-酮的减少。可通过使这两种酵母基因失活减少副反应的产生。研究结果可使HC占所有类固醇产物的70%，理想情况下副产物仅有11-脱氧皮质醇和皮质酮。该方法简洁，有望成为HC生产的新途径。

    4  结语

    综上所述，目前甾体微生物转化中受到人们关注的领域有［23，30～33］：①将微生物基因工程的概念应用于甾体微生物转化，整体生物催化；②发展酶催化，通过修饰和固定化以提高选择性、稳定性、利于它们的协同催化及循环利用；③提高水不溶性底物的溶解度或提高酶和细胞在有机相中的生物活性及稳定性；④发展酶的在线再生和循环催化、有用物连续回收，更好地利用作为废料的甾醇化合物以生产有用的甾体化合物中间体；⑤修饰培养基、产物连续采出以提高收率和产量。人们希望在控制微生物转化方面能进一步发展，以进一步降低成本。

    我国是甾体激素药物的生产大国，其中HC又是产量很大的品种。但是HC的微生物转化收率与国外先进水平存在一定差距，故在对发酵工艺条件改进的同时，需要进一步加强对HC基因工程和代谢组学的研究、开发全生物合成新工艺，加速新菌种引进及菌种改良，以提高其选择性、耐受性和转化率；另一方面药物合成需要与反应器设计、分离纯化、过程强化等化学工程技术更加紧密合作，尽快建立起多药源、快速量产的柔性制药工程体系，使我国早日成为具有循环特点的甾体药物生产强国。

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