20株阴沟肠杆菌耐药性及耐复方磺胺甲口恶唑相关基因研究

                     作者：蔡培泉 黄支密 王春新 糜祖煌

【摘要】  目的 探讨临床分离的阴沟肠杆菌耐药性和耐复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)相关基因存在状况。方法 采用ATB药敏试验板微量肉汤法测定临床分离的20株阴沟肠杆菌对20种抗菌药物的敏感性，采用PCR检测耐复方磺胺甲口恶唑相关基因sulI、dfrA1和dfrA17。结果 20株菌对亚胺培南和美罗培南均敏感，对其他抗菌药物的不敏感率在25.0%～100%之间。sulI、dfrA1和dfrA17基因阳性率为85.0%(17/20)、5.0%(1/21)、60.0%(12/20)。结论 阴沟肠杆菌具明显的多重耐药特征。耐复方磺胺甲口恶唑相关基因携带率很高。

【关键词】  阴沟肠杆菌； 复方磺胺甲口恶唑； 耐药基因

    ABSTRACT  Objective  To investigate the antimicrobial resistance and the sulfamethoxazole/trimethoprim resistant associated genes in Enterobacter cloacae.  Methods  Microdilution tests were performed to detect the susceptibility of 20 kinds of antimicrobial agents against 20 strains of Enterobacter cloacae. The sulI, dfrA1 and dfrA17 genes were analyzed by PCR.  Results  There is no strain resistant to imipeneam and meropenem. The resistant rates to other antimicrobial agents between 25.0% and 100%. The positive rates of sulI, dfrA1 and dfrA17 genes were 85.0% (17/20), 5.0% (1/21) and 60.0%(12/20) respectively.  Conclusion  The 20 strains were multiple-drug-resistance. There were very high positive percentages of sulI and dfrA17 genes in Enterobacter cloacae isolated from hospital.

    KEY WORDS  Enterobacter cloacae;  Sulfamethoxazole/trimethoprim (SMZ/TMP);  Drug-resistant genes

    近年来阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)已成为感染的重要病原菌。蔡少华等的呼吸机相关肺炎的病原学和耐药性监测报道中阴沟肠杆菌分离率已居肠杆菌科第三位［1］。我国有关阴沟肠杆菌产AmpC酶、TEM、SHV和CTX-M等类型β-内酰胺酶［2～5］，产氨基糖苷类修饰酶已有报道［6，7］。经检索国内尚无复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)耐药相关基因报道。我们对从临床分离的20株阴沟肠杆菌进行了药敏试验，并检测了SMZ/TMP耐药相关基因sulI、dfrA1和dfrA17，现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  菌株来源及鉴定

    20株试验菌株全部分离自浙江湖州解放军98医院2003年9月～2004年4月住院患者送检的各种标本，其中创伤伤口分泌物13份、痰液4份、烧伤创面分泌物2份、脑脊液1份。用Bio-Merieux公司API 20 E鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218和铜绿假单胞菌ATCC27853。

    1.2  药敏试验

    微量肉汤法，采用Bio-Merieux公司产品ATB  G-5药敏试验板，共测试20种抗菌药物的敏感性。

    1.3  sulI、dfrA1、dfrA17基因检测

    检测采用聚合酶链反应(PCR)法，用蛋白酶K消化法制备DNA扩增模板。根据GenBank()中已发布的sulI、dfrA1、dfrA17基因序列自行设计引物，PCR扩增引物序列及产物长度见Tab.1。各种靶基因PCR扩增体系为：酶反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L，KCl 10.0mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris-HCl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，Taq DNA聚合酶1U。全部反应体积20μl，其中模板液5μl。热循环参数为93℃预变性2min，然后93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，共35周期；最后一个循环72℃延伸至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性，并拍照保存。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

    2.1  药敏试验

    本组菌株多重耐药性严重，仅对亚胺培南和美罗培南全部敏感(Tab.2)。

    2.2  sulI、dfrA1、dfrA17基因PCR检测

    sulI、dfrA1、dfrA17基因阳性率分别为85.0%(17/20)、5.0%(1/21)、60.0%(12/20)。Fig.1为sulI基因PCR产物电泳图。

    20株阴沟肠杆菌SMZ/TMP敏感性和sulI、dfrA1、dfrA17基因检测结果见Tab.3。

    3  讨论

    内病原菌耐药监测网资料显示［8］，近年来阴沟肠杆菌的多重耐药性十分严重，对常用的抗生素的耐药率在逐年上升。由药敏试验结果得知，本组菌株对青霉素类、青霉素类/β-内酰胺酶抑制剂复合物、第一～三代头孢菌素类、复方磺胺甲口恶唑和环丙沙星的耐药率均很高，在80.0%～100.0%之间；对第四代头孢菌素头孢吡肟虽然耐药率较低(25.0%)，但中介率却较高(35.0%)；对碳青霉烯类抗生素无耐药；对4种氨基糖苷类抗生素阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素和奈替米星的耐药率也非常高，在60.0%～90.0%之间。我们曾报道该20株阴沟肠杆菌氨基糖苷类修饰酶基因检出率高［7］。

    复方磺胺甲口恶唑为磺胺甲口恶唑与甲氧苄胺嘧啶的复合制剂，它的抑菌机制为磺胺与对氨苯甲酸(PABA)的化学结构相似，两者竞争二氢叶酸合成酶(DHPS)使二氢叶酸合成减少；甲氧苄胺嘧啶能抑制二氢叶酸还原酶(DHFS)，使四氢叶酸的生成受阻。磺胺药与甲氧苄胺嘧啶合用后，由于两者作用于细菌叶酸合成的不同环节，因而有协同作用［9］。近年来，对细菌的可移动性遗传元件研究发现，Ⅰ类整合子的耐药基因盒中常携带二氢叶酸合成酶的编码基因sulI，有些同时还携带二氢叶酸还原酶的编码基因dfrA(早期中以dhfr表示)［10～12］。为了解阴沟肠杆菌复方磺胺甲口恶唑耐药相关基因存在状况，我们根据GenBank核酸数据库中已发布的Ⅰ类整合子基因序列［12］，自行设计了sulI、dfrA1、dfrA17基因PCR扩增引物。经检测由Tab.3可见，3株复方磺胺甲口恶唑敏感株均无sulI、dfrA1、dfrA17基因检出；17株耐药株中均检出sulI基因，并有12株检出dfrA17基因，1株检出dfrA1基因。表型与基因型基本相符。

【文献】
  ［1］ 蔡少华，张进川，俞森洋，等. 呼吸机相关肺炎的病原学和耐药性监测［J］. 中华医院感染学杂志，2004，14(4)：365

［2］ 吴伟元，陈民钧. 阴沟肠杆菌ampD基因突变与去阻遏持续高产AmpC酶［J］. 中国抗感染化疗杂志，2001，1(2)：65

［3］ 佘丹阳，刘又宁. AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶在阴沟肠杆菌中的表达及对其耐药性的影响［J］. 中华医学杂志，2002，82(19)：1355

［4］ 顾怡明，张杰，俞云松，等. 阴沟肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶的基因型调查［J］. 中国抗生素杂志，2004，29(2)：82

［5］ 李苌清，谢勇恩，凌保东，等. 耐头孢他啶阴沟肠杆菌TEM-28-β-内酰胺酶的特性研究［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(6)：358

［6］ 蔡培泉，赵琪，王春新，等. 临床分离革兰阴性杆菌氨基糖苷类修饰酶基因的研究［J］. 中华医院感染学杂志，2004，14(12)：1332

［7］ 黄支密，糜祖煌，秦玲，等. 20株阴沟肠杆菌耐药性及氨基糖苷类修饰酶基因型分析［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2005，25(5)：428

［8］ 陈民钧，王辉. 中国重症监护病房革兰阴性细菌耐药性连续7年监测研究［J］. 中华医学杂志，2003，83(5)：375

［9］ 汪复. 抗菌药物作用机制和细菌耐药性. 见：闻玉梅主编. 精编医学微生物学［M］. 上海：复旦大学出版，2002：306

［10］ Lee J C, Oh J Y, Cho J W, et al. The prevalence of trimethoprim-resistance-conferring dihydrofolate reductase genes in urinary isolates of Escherichia coli in Korea ［J］. J Antimicrob Chemother,2001,47(5):599

［11］ Lindstedt B A, Heir E, Nygard I, et al. Characterization of class I integrons in clinical strains of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Typhimurium and Enteritidis from Norwegian hospitals ［J］. J Med Microbiol,2003,52(Pt2):141

［12］ Cabrera R, Ruiz J, Marco F, et al. Mechanism of resistance to several antimicrobial agents in Salmonella clinical isolates causing traveler′s diarrhea ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2004,48(10):3934