克拉维酸钾中有关物质的HPLC/ESI/MS分析

【摘要】  目的 检查并推证克拉维酸钾中有关物质。方法 采用HPLC/ESI/MS液质联用技术，液相色谱条件为：色谱柱C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温40℃；流动相A为0.01mol/L乙酸铵，流动相B为流动相A和乙腈(1∶1)混合物；流速1ml/min；柱后分流1∶1；检测：UV230；线性梯度洗脱。质谱条件：离子源：ESI；检出模式：正负离子二种形式；扫描范围：50～800m/z；电离电压：3.0kV；电喷雾接口干燥气(N2)流速318L/h；离子源温度150℃；锥孔电压30V。结果 从克拉维酸钾中分离鉴定出6种有关物质，其中3种与欧洲药典列举的有关物质相同。结论 克拉维酸钾在生产过程中生成多种有关物质，该方法为研究和鉴定克拉维酸钾中有关物质及其来源，提高药品质量和安全性提供了技术支持。

【关键词】  克拉维酸钾； 液质联用技术； 有关物质

    ABSTRACT  Objective  To analyze the related substances in clavulanate potassium.  Methods  HPLC, electrospray ionzation and selective ion monitoring mass spectrum method were used; the HPLC condition: column C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), temp: 40 ℃, mobile phase: A) 0.01 mol/L ammonium acetic; B) mixture of mobile phase A and acetonitrile (1∶1); flow rate: 1 ml/min; postcolumn split ratio: 1∶1; detection: UV 230nm; elute by linear gradient. MS parameter: ion source: ESI(+); 50～800 m/z; ionization voltage: 3.0 kV; dry gas (N2) flow rate: 318 L/h; temp:150 ℃; emale cone voltage: 3.0 kV.  Results  Six related substances were separated in products, of which three were elucidated in the EP.  Conclusion  There were several related substances during production of clavulanate potassium. HPLC/ESI/MS provided an effective method to determine the related substances and ensure the quality and safety of the product.

    KEY WORDS  Clavulanate potassium;  Chromatography?Mass spectrometry;  Related substances

    克拉维酸钾(clavulanate potassium)是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种β?内酰胺酶抑制剂，它与该酶可发生不可逆的结合使酶失活［1］。克拉维酸钾的化学性质不稳定，在生产和储存过程中容易发生化学变化，引入杂质。根据“人用药品注册技术规范的国际协调会”(ICH)的要求，超过0.1%的杂质需鉴定出来并且用选择性好的方法进行定量分析，在欧洲药典中已经列举了克拉维酸钾中部分有关物质的化学结构［2］。 由于生产菌种、原料和工艺路线的不同，国内生产的克拉维酸钾所含的有关物质不一定与欧洲药典列举的相同，为提高药品质量，保证用药安全性，需要对克拉维酸钾中有关物质进行研究确定。色谱?质谱联用技术(Chromatography?Mass Spectro?metry)是当代重要的分离和鉴定分析方法之一，广泛应用于医药研究领域［3］。液相色谱具有高效的分离性能；而质谱具有高灵敏度和高选择性，能为结构定性分析提供较多的信息。因此本研究选用HPLC/ESI/MS的方法对克拉维酸钾的有关物质进行检测分析。

    1  仪器与材料

    仪器  Agilent 1100高效液相色谱仪，含在线真空脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管矩阵检测器(DAD)；API 4000 LC/MS/MS system。

    试剂与试药  乙腈为色谱纯试剂(TEDIA公司，美国)；乙酸铵为分析纯试剂；水为超纯水；克拉维酸钾原料(批号20070921)由本公司生产。

    2  克拉维酸钾有关物质测定

    2.1  样品处理

    精密称量克拉维酸钾原料药适量，用0.01mol/L乙酸铵超声溶解并稀释成10mg/ml的溶液，进样前用0.01mol/L乙酸铵稀释1000倍，经0.45μm滤膜过滤后上样。

    2.2  液相色谱条件

    色谱柱C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温40℃；流动相A为0.01mol/L乙酸铵，流动相B为流动相A和乙腈(1∶1)混合物；流速1ml/min；柱后分流1∶1；检测：UV230；线性梯度洗脱：0～15min，100% A～50% B；0% B～50% B。

    2.3  质谱条件

    API 4000电喷雾质谱仪，离子源：ESI；检出模式：正负离子2种形式检测；扫描范围50～800m/z；电离电压3.0kV；电喷雾接口干燥气(N2)流速：318L/h；离子源温度150℃；锥孔电压30V，二极管矩阵检测器与质谱串联，两者之间的滞后时间约为0.4min。

    3  结果

    3.1  分离检测结果

    克拉维酸钾样品的HPLC图谱和质谱总离子流(total ion current)图分别见图1和图2。TIC图中出现8个色谱峰，它们的保留时间分别为2.71、3.15、5.70、6.60、6.92、7.10、12.87和16.48min，其中保留时间为2.71min的色谱峰可能是溶剂峰，7.10min的色谱峰为克拉维酸色谱峰。对克拉维酸色谱峰用3D UV光谱和质谱进行峰纯度检测，主峰纯度单一，不含未被分离的杂质。

    3.2  主要有关物质鉴别

    分别对TIC色谱图中保留时间为3.15、5.70、6.60、6.92、12.87和16.48min的色谱峰进行检测，得到质谱图分别见图3～图8。按出峰的顺序分别定义为有关物质I、II、III、IV、V和VI，其分子的离子峰［M+H］+m/z分别为104.2、456.3、232.3、282.3、241.3和197.4，分子量分别为103.2、455.3、231.3、281.3、240.3和196.4。进一步分析选择性离子流提供的信息，结合解析总离子流各峰的质谱，有关物质IV、V和VI与欧洲药典列举的有关物质G、B和C相同，可能结构分别为4?{［(1S)?1?羧基?2?(4?羟苯基)乙基］氨基}?4?琥珀酰酪氨酸(有关物质IV)；2，2′?(3?乙基吡嗪?2，5?双二乙醇(有关物质V)；3?(3，6?二(2?羟乙基)吡嗪?2?丙醇酸(有关物质VI)。

    4  讨论

    (1)试验过程中发现，HPLC/ESI/MS联用检测时， 在ESI(+)离子化方式下克拉维酸钾在质谱上无 响应，在ESI(-)离子化方式下有响应。另外用水做溶剂与直接进样质谱，两种条件下克拉维酸钾都有响应(图略)。推测可能是由于在流动相中克拉维酸为负离子，只有在酸性很强的条件下，才为正离子，因此不能检测到正离子。

    (2)克拉维酸钾是由微生物发酵产生的抗生素，有关物质的产生与生产条件有关。实验中用HPLC/ESI/MS检测发现其中三种有关物质是欧洲药典列举的有关物质，还有三种是未知物质，这应我们的生产菌种、原料、生产工艺和国外不同有关。为了提高药品质量，保证用药安全性，我们需要进一步分离未知杂质，运用红外光谱、核磁共振等方法鉴定其化学结构。

【】
  ［1］ 孟勇，张国华，王忠彦，等. β?内酰胺酶抑制剂克拉维酸研究进展［J］. 抗生素杂志，2003，28(1)：60～64.

［2］ Council of Europe. The European pharmacopoeia ［S］. Vol 2. Ligugé: Aubin in France,2005,5(2):230.

［3］ 刘祥东，梁琼麟，罗国安，等. 液质联用技术在医药领域中的应用［J］. 药物分析杂志，2005，25(1)：110～116.