选育紫杉醇高产菌种链格孢单孢变种
作者：段丽丽 陈鸿锐 陈杰鹏 李卫潘 洪琳
【摘要】 以从红豆杉树皮中分离得到的高产紫杉醇(paclitaxel)菌株013为出发菌株，采用紫外线诱变、亚硝基胍诱变交替进行的方法，同时复合含1%乙酰胺的理性化筛选模型，获得一株遗传性状稳定的链格孢单孢变种ST026，摇瓶发酵产量可稳定达到227mg/L，比出发菌株产量提高81.6%。
【关键词】 紫杉醇； 诱变； 链格孢单孢变种； 理性化筛选
ABSTRACT The starting strain Alternaria alternate 013, isolated from the bark of taxus yunnanensis, is a high?yield paclitaxel producing strain. This strain is undergone mutation by UV and NTG interactively. Combined with 1% acetamide rational?screening model, we had obtained an inherited stable strain, named as Alternaria alternate var.monosporus ST026. The stable productivity of paclitaxel is up to 227mg/L in flask culture which has increased by 81.6% compared with the starting strain.
KEY WORDS Paclitaxel; Mutation; Alternaria alternate var. monosporus; Rational screening
紫杉醇是最有效的抗癌药物之一，已有15年。为解决其来源问题，紫杉醇生产技术历经四代更替：第一代技术为从红豆杉树皮中提取纯化；第二代技术为以大量红豆杉种植园为支撑，从红豆杉树叶中提取中间体10?DAB，再经半合成而得；第三代技术为红豆杉植物细胞培养，从中提取纯化而得；第四代技术为微生物发酵技术。从的观点看，微生物发酵生产技术最具竞争力。作者从红豆杉树皮中分离、筛选到高产紫杉醇的真菌，再经菌种诱变、改造不断提高紫杉醇产生菌的产量和菌种的稳定性，取得了一定的效果。该研究成果已获得国家专利［1］、国际PCT专利［2］和美国专利［3］保护。
1 材料与方法
1.1 出发菌株
链格孢013(Alternaria alternate 013)由汕头市双骏生物工程有限公司从红豆杉树皮中分离获得，经中山大学生物工程研究中心运用核糖体RNA基因分析鉴定为Alternaria alternate的不同株系。
1.2 培养基及培养条件
(1)斜面培养 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，25℃培养5～7d。
(2)理性化筛选培养 含1%乙酰胺的PDA培养基，25℃培养5～7d。
(3)种子培养 葡萄糖10g，蔗糖40g，黄豆饼粉3g，硫酸镁0.1g，碳酸钙1g，硫酸锰0.7mg，硫酸亚铁2mg， 三氯化铁1mg， 碘化钾1.4mg， 硼酸1mg， VB110mg， 蒸馏水1000ml；pH6.8，25℃，175r/min，摇床培养38h。
(4)发酵培养 蔗糖50g，黄豆饼粉2.5g，酵母浸膏0.5g，硫酸镁0.6g，碳酸钙1g，硫酸锰0.7mg，硫酸亚铁2mg，三氯化铁1mg，碘化钾1.4mg，硼酸1mg，VB1 10mg，蒸馏水1000ml；pH6.8，25℃，175r/min，摇床培养8d。
1.3 菌种诱变与筛选
(1)紫外照射单因子处理［4］ 用25℃恒温培养7d的成熟斜面菌株作为出发菌株，制得单孢子悬液置平皿中，紫外灯(30W，波长254nm，距离30cm)照射3min，孢子液适当稀释后涂布于PDA平板培养基上。培养7d后挑取单菌落进行摇瓶筛选。
(2)紫外线照射复合理性化筛选 制备含有1%乙酰胺的PDA培养基平板，将UV处理过的孢子液适当稀释并涂布于含乙酰胺的平板培养基上，培养7d后挑选孢子丰富、色素深、菌落黑色边缘较大的菌落进行摇瓶筛选。
(3)亚硝基胍单因子处理［4］ 用25℃恒温培养7d的成熟斜面菌株作为出发菌株，用含0.1%葡萄糖、1mg硼酸的无菌水溶液制得单孢子悬液，置于三角瓶内，于25℃培养6～8h，使孢子萌发，离心弃上清得孢子沉淀，再用配制好的亚硝基胍溶液在避光环境下作用2h，亚硝基胍作用浓度为2mg/ml，作用终止后，孢子悬液适当稀释涂布于PDA平板培养基上。培养7d后挑取单菌落进行摇瓶筛选。
(4)亚硝基胍作用复合理性化筛选 制备含有1%乙酰胺的PDA培养基平板，将亚硝基胍处理过的孢子悬液适当稀释并涂布于含乙酰胺的平板培养基上，培养7d后挑选孢子丰富、色素深、菌落黑色边缘较大的菌落进行摇瓶筛选。
1.4 发酵终产物产量检测
紫杉醇对照品为Sigma公司产品。
(1)样品处理 定量取发酵液，过滤得菌体，于55℃干燥，粉碎，用乙酸乙酯∶丙酮(1∶1)浸提3d，取有机相挥干溶剂得浸膏。
(2)薄层色谱法 展开剂为三氯甲烷∶乙醇(19∶1.5)，显色剂为乙醇∶浓硫酸(19∶1)。
(3)HPLC检测 外标法，固定相为C18柱(5μm)，流动相为70%甲醇，柱温30℃，检测波长227nm，流速为0.9ml/min。方法：
样品的浓度=标准品浓度×标准品进样体积×样品峰面积样品进样体积×标准品峰面积
1.5 发酵终产物鉴定
红外光谱、紫外光谱、质谱和核磁共振均由中山大学测试中心检测。
2 结果
2.1 菌种诱变谱系
其中，013菌株和ST166菌株形态为多细胞的链格孢菌；ST768、ST289和ST026为单细胞突变株。
2.2 摇瓶筛选结果
出发菌株013经过紫外线和亚硝基胍交替处理，并用含有1%乙酰胺的PDA培养基作为理性化筛选培养基，最终获得ST026高产突变株，其摇瓶产量比013提高了81.6%。四种诱变筛选方法所获得正变株的突变率和紫杉醇产量见表1。
由表1可以看出，用含1%乙酰胺的PDA培养基作为筛选培养基所得菌株的产量提高幅度较大，正突变率高，且单菌落高产形态表现明显。
ST026菌株发酵提取物与紫杉醇对照品的薄层色谱图(图1)和HPLC图(图2、图3)比较，再经中山大学测试中心鉴定，结果表明两者一致。
2.3 高产突变株的菌体及菌落形态变化
ST026高产突变株的菌落形态与原始的出发菌株表1 四种诱变筛选方式获得正变株(系谱菌株)的摇瓶发酵产量013相比，形态变化较大。013菌株在PDA培养基上生长迅速，4d即可平铺培养皿表面，产生丰富的孢子，孢子通常呈黑色或橄榄绿色，孢子棒状、卵形、椭圆形，大小为［22～31(25)］×［9～13(11)］μm，有4～5个横隔，2～3个纵隔或斜隔，色深，表面有疣状突起(图4)。显微镜下013菌株孢子形态见图5。ST026菌株在PDA培养基上菌落表面紧密、毡状，黑色，菌落边缘基内黑色素明显。菌丝细胞长宽大约相等或长大于宽2倍左右，细胞中间缢缩，两端膨大，在横隔处也缢缩，整条菌丝似链条状。分生孢子为单细胞，大小约为20～25um，无色透明，无疣状物(图6)。
ST026菌株已经申请了国家专利保护，专利号CN1724643A。该菌株由国家微生物保存中心保藏，保藏号ST?026?R CGMCC No.0899。
2.4 高产菌株遗传稳定性考察
ST026菌株经连续五次斜面传代后与F1代进行生长速度、菌体形态、摇瓶发酵产量情况对比，结果表明经五代传代后菌体生长速度、 菌体形态以及发酵产
图4 分离得到的产紫杉醇的野生菌013菌种形态
(10×100)量与F1代基本一致。证明该菌株遗传稳定性良好。
2.5 高产菌株斜面4℃冰箱保藏稳定性考察
ST026菌株转种于PDA斜面培养基，于25℃培养7d，于4℃冰箱恒温保藏。经活化传代后进行生长速度、菌体形态、摇瓶发酵产量情况对比，结果表明ST026菌株4℃冰箱中保藏45d，其形态和产量与原种一致。提示4℃冰箱保藏的该菌株应在45d内使用。
2.6 高产菌株保藏稳定性考察
ST026菌株采用冷冻干燥保藏方法，以脱脂奶为保护剂进行保藏。在保存后即刻、一个星期、一个月、两个月、三个月、半年、一年、两年、三年、五年等分别进行保藏稳定性考察。结果表明，经保藏后的菌株菌体生长速度、菌体形态以及发酵产量与原种基本一致。证明该菌株保藏稳定性良好。
3 讨论
研究过程中发现，在含有1%乙酰胺的PDA培养基上，紫杉醇产生菌的高产形态特征表现明显，且产量提高幅度较大。原因可能是乙酰胺可以作为该微生物发酵生产紫杉醇的前体物质，因此在诱变过程中加入乙酰胺，提高了该菌株对乙酰胺的利用率，也提高产量。在紫外诱变复合1%乙酰胺的理性化筛选过程中获得紫杉醇高产的单细胞突变株ST768。选用紫外诱变法和亚硝基胍诱变法交替进行的诱变处理，正突变株得率较高，产量提高幅度较大。
利用ST026菌株发酵生产紫杉醇项目在国家各级政府部门的支持下，已完成小试阶段，目前产量可达227mg/L。ST026菌株发酵产物组分复杂，产量不高，还有大量工作要做。 图5 分离得到的产紫杉醇的野生菌013孢子
电镜下形态 图6 诱变得到的紫杉醇高产菌株ST026菌种形态
(10×100)
【】
［1］ 汕头市双骏生物科技有限公司. 一种新的菌株及应用该菌株生产紫杉醇的方法：，1724643A ［P］. 2006?01?25.
［2］ Strandbioscience company limeted. A micro?organism and a method of producing paclitaxel by the use of the same: PCT WO2006/009518 A1 ［P］. 2006?01?26.
［3］ Strandbioscience company limeted. A micro?organism and a method of producing paclitazel by the use of the same: USA. US20070218531 A1 ［P］. 2007?10?20.
［4］ 施巧琴，吴松刚. 微生物育种学［M］. 北京：出版社，2003:73～75.
