微生物来源的醛糖还原酶抑制剂的研究进展
作者：汪学军 陈代杰 杨志钧
【摘要】 糖尿病并发症与糖代谢多元醇通路激活有关。醛糖还原酶是多元醇代谢通路中的限速酶，醛糖还原酶抑制剂能有效抑制此通路，减慢或改善糖尿病并发症。本文主要概述了微生物来源的醛糖还原酶抑制剂的研究进展。
【关键词】 醛糖还原酶抑制剂； 糖尿病并发症； 微生物来源
ABSTRACT Diabetic complications is related to the activation of polyalcohol pathway. Aldose reductase is a key rate?limiting enzyme in the pathway, while aldose reductase inhibitors can inhibit the pathway and alleviate the symptoms of diabetic complications. This review mainly gives a brief account of the progress of research on aldose reductase inhibitors from microorganisms.
KEY WORDS Aldose reductase inhibitors; Diabetic complications; Microbial origin
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种多病因的代谢性疾病，其特征之一就是葡萄糖代谢异常和某些组织中高血糖状态。1995年，世界卫生组织统计全世界糖尿病在成人中发病率为4%，预计在2025年将达到8%［1］。尽管可以用胰岛素对糖尿病患者进行，但还是会留下危及许多组织和器官的糖尿病并发症(diabetic complications)，如糖尿病性白内障、动脉粥样硬化、周围神经疾病、肾脏病变和视网膜病变等［2］。糖尿病并发症不仅威胁人类健康和生命安全，降低生活质量，而且带来沉重的负担。
1 醛糖还原酶与糖尿病并发症
现有的大量研究表明，多元醇通路激活是继发性糖尿病并发症主要原因。糖尿病并发症与糖代谢的多元醇通路(图1)激活有关。 多元醇通路由醛糖还原酶图1 多元醇通路
(EC.1.1.1.21，aldose reductase，AR)和山梨醇脱氢酶(SDH)共同调控。AR是一种细胞溶质酶，广泛存在于哺乳动物组织中，如晶状体上皮细胞、视网膜、周围神经细胞、肾脏、胎盘、睾丸和胰腺细胞中等。AR以还原型辅酶Ⅱ(NADPH)为辅酶，将葡萄糖还原为山梨醇；山梨醇在氧化型辅酶I(NAD)的参与下，由山梨醇脱氢酶氧化为果糖［3，4］。
AR是多元醇通路的关键限速酶，在正常血糖浓度时AR并不被激活，活性不高，代谢率极低，但如血糖浓度超过正常生理水平，催化葡萄糖转化为6?磷酸?葡萄糖的己糖激酶被饱和，AR将被激活，葡萄糖的代谢速率增加2～4倍，促使体内的葡萄糖转化成山梨醇。但山梨醇脱氢酶的活力并未呈比例地相应增加，山梨醇又由于自身极性大而不易通过细胞膜，所以在细胞内造成了山梨醇的蓄积，造成细胞渗透性水肿，改变细胞膜的通透性，同时细胞内山梨醇大量蓄积也可使Na+、K+?ATP酶活性下降，细胞中肌醇流失，导致细胞代谢与功能的损害，出现糖尿病并发症等器官病变。
通过抑制AR的活性能减少山梨醇的生成，有效防止和改善糖尿病并发症，所以，通过以AR为靶点醛糖还原酶抑制剂(aldose reductase inhibitors，ARIs)的筛选研究工作，成为糖尿病并发症治疗药物开发热点。
2 ARIs筛选模型的研究
任何药物的开发都离不开一个有效的筛选模型。针对AR为靶点的ARIs筛选，分为体内筛选和体外筛选，体内筛选是利用动物模型进行筛选，而体外筛选分为无细胞相水平筛选和细胞相水平筛选。
实验中的AR主要来源于大鼠、牛、猪、人和兔。1965年，Selma等首次从小牛的晶状体中分离到AR，并对AR的制备、活性测定及性质作了详细的阐述。该法是取小牛晶状体，经匀浆、离心后，上清中加入不同浓度的硫酸铵溶液去杂质，最后加75%硫酸铵饱和溶液，得到粗酶制品，再经透析、DEAE?cellulose柱层析获得纯品。后来又制备了不同动物来源的AR，方法大多类似。
糖尿病动物模型是最早用来筛选ARIs的模型，目前广泛应用的是体外筛选模型。体外筛选模型是先培养糖尿病动物模型即四氧嘧啶(alloxan)诱导模型和链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导模型，而后取血，体外测定AR的活性变化，作为评价ARIs的重要指标。测定红细胞中AR活性的方法有分光光度法、荧光法和ELISA法。利用无细胞相水平筛选ARIs是直接用纯化的AR在人工反应体系中测定化合物对AR活性的抑制作用。
应用96孔石英板成功建立的ARIs的微量高效筛选模型，较传统的石英比色皿法效率提高10倍之多，此模型简便易行、成本低，可以筛选多来源的化合物，并且利用此模型开展了从生物产物中筛选ARIs的工作，已累计筛选真菌和稀有放线菌样品1500个，其中阳性样品6个，说明该模型有效［5］。闫泉香等［6］利用体外细胞培养研究了黄酮类ARIs的活性，通过测定样品对红细胞山梨醇生成的影响来测定化合物的抑制作用。通过组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞，高效液相色谱测定反应体系中反应后剩余的醛糖还原酶的辅酶NADPH的荧光强度，推算出反应体系中醛糖还原酶的活性，逆转录聚合酶链式反应(RT?PCR)检测醛糖还原酶mRNA的表达，这种方法简便、可靠，既可以用于高通量ARIs筛选，也可在此模型的基础上进行相关的药物筛选以及药物作用机制的研究［7］。刘英华等［8］从大鼠晶状体中提取AR，通过改变酶促反应条件最终确立整个反应体系的组成，建立了ARIs筛选模型，并利用此模型检测槲皮素对AR的抑制作用。
3 微生物来源的ARIs
ARIs来源主要有：①由化学合成制备，主要代表有托瑞司他(tolrestat)和依帕司他(epalresta)；②从植物筛选得到，代表化合物槲皮素；③从微生物筛选得到。从微生物的代谢产物中寻找有潜在治疗价值的药物，一直是科研工作者的首选目标，ARIs也不例外，在这一方面，日本学者做了许多研究，取得了一定的成绩。截止目前，已从微生物产物中筛选出20多种ARIs，并且有的ARIs的IC50值很小，主要来源于真菌和放线菌，而细菌来源的目前尚没有相关报道。
微生物是化合物多样性的重要来源，它们中许多具有生物活性或药用特性。微生物来源的潜在ARIs种类丰富，建立ARIs化合物库，分析其构效关系，找到必需基团，可为ARIs化合物提供合成的前体；从目前已分离到的微生物来源的ARIs出发，找出它们共有的特征，也可启发人们设计更高活性的ARIs。以下就近年来从微生物来源中所得到的ARIs的种类及活性(体外测定)研究做一概括的介绍。
最早从微生物中得到ARIs是Nishikawa等［9］报道的，他们在日本福岗地区土壤中筛选到真菌Chaetomella raphigera，从其发酵液乙酸乙酯部分分离得到WF?3681(2，图2)对兔晶状体AR具有抑制活性，其IC50为0.25μmol/L，活性明显高于IC50为0.42μmol/L的索比尼尔对照样品；后来合成出WF?3681的一系列衍生物，并且分析了构效关系，实验证明WF?3681及其衍生物均能抑制糖尿病大鼠中的山梨醇积累，其中的一种衍生物(3，图2)效果最好。
从束丝放线菌Actinosynnema sp.和淡紫色拟青霉Paecilomyces lilacinus中都能分离得到苯并噻唑(4，图2)，在0.445μmol/L时对人胎盘AR有抑制作用。后来，Ozasa等［10］从Actinosynnema sp.C?304菌株的代谢产物中分离纯化得到两种新的物质——Thiazocins A和B，这两种物质对人胎盘AR有很强的抑制作用，IC50分别为0.455和0.220μmol/L。
Aldostatin(5，图2)是从日本土壤中筛选到的真菌Pseudeurotium zonatum M4107代谢产物，对牛晶状体AR有抑制活性［11］。后来从灰色腐质霉Humicola grisea的代谢物中筛选到一种Aldostatin结构类似物WF?2421(6，图2)，这种类似物对兔晶状体AR有显著的抑制作用，其IC50为0.03μmol/L［12］。
从Crucibulum sp. RF?3817的发酵产物中分离得到对鼠晶状体醛糖还原酶(RLAR)显示较强抑制的活性物质Salfredins A3、A4、A7、C1、C2、C3和B11等7种化合物，其中A4、B11(7、8，图2)活性较高，进一步研究发现它们都含有一个甘氨酸基团，此基团与抑制活性有密切相关［13］。
在青霉属的Penicillium citrinum发酵液中分离得到对RLAR有抑制作用的桔霉素(9，图2)；此外，在另一种青霉属的P.corylophilum也分离到对RLAR有抑制作用的化合物DHMI(10，图2)，它们的IC50都在10μmol/L左右。以这两种化合物为基础的衍生物已被合成和进一步研究，其中之一的dihydrocitrinin(11，图2)是对AR的一种不可逆抑制剂，并且有稳定有效的活性［14］。最近Lu等［15］从海洋真菌Penicillium
图2 微生物来源的部分ARIs化学结构式citrinum B?57中也分离到桔霉素衍生物，对RLAR的IC50为0.8μmol/L。
Yoshida等［16］从真菌属的Chaetomella circinoseta代谢产物中分离得到了对RLAR有抑制作用的化合物(12，图2)，其IC50为0.016μmol/L，效果明显好于IC50为0.027μmol/L的对照组托瑞司它。
从嗜碱棒状杆菌Corynebacterium sp.发酵液中分离得到的YUA001(13，图2)对猪肾AR的抑制活性IC50为1.8×10-3mol/L［17］。强翔等［18］应用ARIs微量高效筛选模型对数千株阳性菌株进行筛选，其中灰色链霉菌SIPI?99?807的代谢产物5，7?二羟基?3?(4′?羟基苯酚)?4氢?1?苯并吡喃?4?酮(14，图2)对牛眼晶状体AR有抑制活性。后来，任晓等［19］从云南筛选得到N99?253菌株，发酵分离获得了结构类似物质异黄酮类化合物7?(α?L?鼠李糖基)?5?羟基?3?(4′?羟基苯酚)?4氢?1?苯并吡喃?4?酮(N99?253B)(15，图2)，针对猪晶状体AR活性测定IC50为75μg/ml［19］。
2002年Rao等［20］从黑曲霉Aspergillus niger CFR?W?105菌株代谢产物中分离得到nigerloxin(16，图2)，它对RLAR的IC50值为69μmol/L。2003年Rao等［21］又从Aspergillus niger CFR?1046菌株的发酵产物中分离得到asperaldin，对AR显示较强的抑制作用，IC50为27μmol/L。
Fujita等［22］从曲霉Aspergillus sp.HK?388的发酵液中分离出对人重组体AR(HRAR)呈抑制活性的黄酮类化合物8?羟基黄豆苷元(8?hydroxydaidzein)(17，图2)，其IC50为4.2μmol/L；对照品为一种常用黄酮类物质槲皮素，其IC50为2.7μmol/L，活性弱于槲皮素，8?羟基黄豆苷元表现为非竞争性抑制。研究发现，与8?羟基黄豆苷元结构类似的物质黄豆苷元在100μmol/L时对HRAR也不能表现出任何活性，从结构上发现可能是在环上的邻二羟基决定其是否有活性。
2005年Dong等［23］从云南土壤的Streptomyces diannanensis中分离出了两种异黄酮鼠李吡喃糖苷类化合物N99?596A和B(18、19，图2)，它们对AR的体外IC50分别为170和165μmol/L。
2006年任晓等［24］利用高通量ARIs筛选方法，从数千株放线菌和真菌中筛选得到阳性菌株邬氏黄丝曲霉(Talaromyces wortmannii)，并从发酵产物中分离得到活性化合物F01?195A(20，图2)，其对猪晶状体有抑制作用，IC50为57.2μmol/L。Chidananda等从青霉属的Penicillium frequentans发酵液中分离得到一种有效的ARIs核丛青霉素(21，图2)，对RLAR的IC50为0.4μmol/L，其活性显著高于同一实验室的所发现的ARIs——nigerloxin和asperaldin［20，21，25］。
最近，有从大型真菌的子实体中抽提分离得到ARIs的报道。Sanghyun等［26］从灵芝Ganoderma applanatum子实体提取液分离得到7种结构不同的RLAR，依次为D?甘露醇、2?甲基?脂肪酸、单糖脑苷类化合物、胡萝卜甾醇、2，5?二羟基苯乙酮、2，5?二羟基苯甲酸和3，4?二羟基苯甲醛，其中3，4?二羟基苯甲醛活性最强(22，图2)，IC50为0.7μg/ml，可能成为一种较好的糖尿病并发症的抑制剂和治疗剂。Lee等［27］首次从平盖灵芝的子实体中分离到一种麦角甾醇过氧化物化合物(ergosterol peroxide)(23，图2)，经过测定发现其对RLAR表现出较好的抑制活性，IC50为15.4μg/ml。
4 结语
目前已报道二十多种微生物来源的ARIs，尽管动物实验已证明许多ARIs有抗糖尿病并发症的作用，也筛选出了一些高效的ARIs，但由于此类药物大多选择性较差、毒性大，限制了其临床使用。目前这是ARIs新药开发进程中存在的主要难题，设计出合理高效的筛选模型对筛选高效低毒的ARIs是必不可少的，也是未来研究的一个重点。
我国是一个物种非常丰富的国家，微生物资源特别丰富，为ARIs来源提供了广泛而难得的条件；微生物具有来源广、种类多的特点，目前人们只分离到界现有微生物的1%，未知微生物资源的开发具有广阔的前景。为寻找新型高效、安全的ARIs，我们需要开拓视野，从植物内生菌、海洋微生物和极地微生物资源等多方面寻找突破口。更多的天然产物中新的醛糖还原酶抑制剂的发现，以及ARIs化合物库的建立也将为通过化学改造获得高效低毒的ARIs提供思路。
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