利用卡尔费休容量法测定妥布霉素晶体中的水含量
作者：朱亮 谌怡 高毅颖 王静康
【摘要】 由于妥布霉素固体颗粒在常用滴定溶剂中的溶解度不大，采用常规的卡氏容量法难以快速精确的确定其水含量。本文讨论了两种新方法：第一种是改变滴定溶剂的组成，向其中添加一定量的甲酰胺［甲酰胺∶甲醇(1∶3，V/V)］以提高样品在溶剂中的溶解度；第二种方法是在超声波的作用下把样品溶于纯甲酰胺中，把妥布霉素固体样品转化成液体样品，再通过测定液体样品的水含量间接确定妥布霉素固体的水含量。两种方法都能精确测定妥布霉素的水含量，但后者与前者相比分析速度更快。上述两种方法也适用于其它在卡氏工作溶剂中溶解度不大的氨基糖苷类物质。
【关键词】 卡尔费休法； 水含量； 妥布霉素
ABSTRACT As for the poor solubility of tobramycin crystalline product in working medium used in volumetric Karl Fischer titration, two new methods for the water content determination were investigated. The first way was introducing the sample directly in the methanol?based working medium, modified by formamide ［formamide∶methanol (1∶3, V/V)］ in order to increase the solubility; the second way was dissolving them in pure formamide stimulated by ultrasonic and the water content of tobramycin was calculated indirectly by determining the moisture content of formamide solution. Both methods were able to accurately determine the water content in tobramycin and the latter was less time?consuming. These methods were also applicable for the water content determination of other aminoglycosides that were not readily soluble in the working medium.
KEY WORDS Karl Fischer method; Water content; Tobramycin
妥布霉素是由黑暗链霉菌发酵获得的一个具有广谱抗菌活性的第二代氨基糖苷类抗生素［1］(图1)。在低浓度下能抑制革兰阴性菌，对铜绿假单孢菌有很强的抑制作用，比其它氨基糖苷类抗生素强2～8倍，被临床广泛应用。妥布霉素一般以粉末状的晶体形态存在，这种形态具有良好的流动性和稳定性，利于储藏、运输和进一步加工。妥布霉素具有强吸湿性［2］，直接暴露在空气中很容易吸湿而产生团聚、结块等现象，因此在妥布霉素的生产和存储过程中，需要一种快速而准确的水含量检测方法来监控妥布霉素产品的水含量变化，至今关于妥布霉素水含量的检测方法鲜见报道。 卡尔费休滴定法简称卡氏滴定法，是在卡氏反应的基础上建立的一种测定样品水含量的新方法［3］。卡氏滴定法测定结果准确可靠、重复性好，滴定时间短，已被列为多种物质快速测定水分的标准方法。
在卡尔费休滴定过程中，样品中的水分需要与溶剂直接接触才能被检测到［4］，这就要求样品必须完全溶解在滴定溶剂中，使样品中的水分得到充分的释放。在卡氏反应中，一般用甲醇作为工作溶剂，但是妥布霉素仅微溶于甲醇，因此提高妥布霉素在工作媒介中的溶解度成为采用卡氏滴定法测定妥布霉素水含量的前提。本文建立了两种卡氏水分析样品处理方法，并以此图1 妥布霉素的化学结构
精确确定妥布霉素样品中的水含量，同时对两种方法的分析结果进行相应的对比。
1 实验材料及方法
1.1 仪器和试剂
卡尔费休滴定仪(DL18，瑞士Mettler?Toledo公司)，超声波清洗器(KQ3200E，昆山市超声波仪器有限公司)，天平(AL204，瑞士Mettler?Toledo公司)，秒表(DM1?001，东莞市塘厦永先电子仪器厂)。
甲酰胺(天津大学科威公司)，3A分子筛(天津江天化工技术有限公司)，二次蒸馏水(市售)，双组分无吡啶卡尔费休滴定剂(5mg H2O/ml)和溶剂(天津四友公司)，妥布霉素(重庆大新药业有限公司，实验室重结晶提纯)。
1.2 测定原理
卡尔费休容量法是测量水分最专一、经典的方法，其工作原理主要基于卡尔费休反应［4，5］。
ROH+SO2+Z→ZH++ROSO-2(1)
ZH++ROSO-2+I2+H2O+2Z→3ZH++ROSO-3+2I-(2)
总反应：
3Z+ROH+SO2+I2+H2O→3ZH++ROSO-3+2I-(3)
市售卡氏溶剂中ROH主要用甲醇，Z用咪唑替代。二氧化硫与甲醇反应生成一种甲基硫酸化合物，而甲基硫酸化合物被咪唑中和。含硫的甲基酸根中的阴离子是反应物，并且已存在于KF试剂中。水的加入使甲基酸根阴离子被氧化成甲基硫酸盐，消耗了水。一旦所有的水都与碘进行了反应，滴定杯中的混合液中就会有游离态的碘，游离碘将促使离子导电并且降低电压，以使极化电流稳定，当电压降至某一设定值时，滴定终止［6］。
本文采用Mettler?Toledo公司生产的DL18卡氏滴定仪作为卡氏滴定分析设备，并采用双组分技术，选用双组分无吡啶卡尔费休滴定剂，以切断延时时间15s为终点判断标准。为确保样品完全溶解，需要对工作媒介进行一定的改进，本实验中采用甲醇和甲酰胺的混合溶剂作为工作滴定溶剂。
1.3 实验方法
(1)实验准备 市售分析纯甲酰胺含水量大约为0.3%，使用前先用3A分子筛干燥48h，用卡氏滴定法精确测定干燥后甲酰胺含水量，保证其含水量不大于0.05%。每次分析前，需要对卡氏滴定剂的滴定度和水分析仪的漂移值进行标定。用精度为0.1μg的天平精确称量20μl蒸馏水，利用仪器的自标定功能对滴定剂进行标定，重复标定三次取平均值，然后标定卡氏滴定仪在工作环境中的漂移值，漂移值应控制在10μg/min左右，最后从测量结果中减去测量过程中产生的漂移量消除漂移值对结果的影响。
(2)用卡氏滴定法直接测定妥布霉素水含量 向滴定池中加入40ml的甲醇?甲酰胺混合溶液，然后加入120mg妥布霉素，在设定的搅拌速度下用秒表测定滴定溶剂完全澄清所需要的时间，澄清后测定其水含量。逐渐提高甲醇?甲酰胺混合溶液中甲酰胺的比例，并分别确定其溶液澄清所需时间和水含量。
(3)利用卡氏滴定法间接测定妥布霉素水含量 向10ml试管中加入200mg妥布霉素，然后加入4.5g甲酰胺，密封管口，放入超声波清洗器的水槽中，在超声波的作用下充分振荡使其完全溶解。用5ml注射器移取3ml妥布霉素甲酰胺溶液，滴加到滴定池中进行分析。
2 结果与讨论
用不同的卡氏滴定法测定妥布霉素水含量，结果列表1。
2.1 常规卡氏滴定法直接测定妥布霉素水含量
不对滴定条件进行任何改进，用卡氏滴定法测定的妥布霉素晶体粉末水含量，直到滴定停止，溶液仍然很混浊，说明样品没有完全溶解。滴定结束后，滴定池中溶液呈棕红色而不是亮黄色，表明分析停止时滴定池中存在过量的碘，导致最后的测量值偏高。这种现象可能与卡氏滴定仪终点判断标准和妥布霉素的物理形态有关。
卡尔费休水分测定仪是通过极化指示电极用电流法或控制电流电位法指示终点［7］。卡氏滴定仪有两个铂电极置入工作媒介中，在两个电极之间施加一定的 表1 不同卡氏滴定法测定妥布霉素水含量 电压使电极极化，电极之间产生一恒定电流。当电极极化所需电压持续低于某一电压的时间超出设定的切断延时时间，仪器停止滴定。
妥布霉素样品属于晶体纤维聚结体。当滴定溶剂中存在大量妥布霉素固体颗粒时，纤维之间很容易互相缠绕形成黏稠的胶体束。当这种黏稠的胶体束慢慢在铂电极上聚集形成一层膜时将影响铂电极的灵敏度，这时铂电极不能及时感应溶液中碘分子的变化而造成最后的结果偏高。另一方面，由于妥布霉素样品没有完全溶解，样品中的部分结晶水没有完全释放出来，这就使得样品中存在一部分水没有被滴定仪检测到。这两方面的原因都可能导致最后的实验结果重现性不好，缺乏可信度。
2.2 改变溶剂组成后用卡氏滴定法测定妥布霉素水含量
与不添加甲酰胺相比，向滴定溶剂中添加一定量甲酰胺能明显改变样品在滴定溶液中的溶解度。有曾报道添加甲酰胺可能会诱发副反应，产生较大的漂移，在高温下这种现象尤为明显［8］，但在常温下这种现象还未见报道。甲酰胺还能加快咪唑的碘化，造成最后结果略微偏高。在甲酰胺的体积含量小于30%的范围内，滴定溶剂中的甲酰胺不会对最后的结果产生影响［9］。
从表2可以看出，随着滴定溶剂中甲酰胺含量不断增加，仪器的漂移值没有明显的变化，说明在整个实验操作条件范围内仪器漂移值并没有因甲酰胺的增加而发生明显的变化。因此可以认为常温下，当甲酰胺在工作溶剂中与甲醇的体积比小于1∶3(V/V)时甲酰胺对实验结果不产生影响。但随着甲酰胺的增加，样品的溶解度显著增大，当工作溶剂中甲酰胺与甲醇体积比小于1∶4时，样品不能完全溶解；若体积比等于或大于1∶4时，样品在一定时间内能完全溶解，并随着溶剂中甲酰胺的比例增大，溶解时间缩短。从样品水含量的测量结果也可以看出，当工作溶剂中甲酰胺与甲醇体积比小于1∶4时，样品水含量均大于4.8，且测量结果随溶剂中甲酰胺含量的变化上下波动较大；当工作溶剂中甲酰胺与甲醇体积比等于或大于1∶4时，测量结果趋于恒定。这说明样品当溶剂中甲酰胺与甲醇体积比等于1∶4时，样品已经完全溶解，样品中的水分已经完全释放出来。溶剂中甲酰胺与甲醇体积比进一步增大只能缩短溶解时间，而不能影响样品中水分的释放程度。
当工作溶剂中甲酰胺与甲醇体积比为1∶3时，样品水含量测定时间为2～3min，样品水含量为4.76%。 表2 改变溶剂组分后用卡氏滴定法测定
妥布霉素水含量
甲醇∶甲酰胺(V/V)1∶08∶16∶14∶13∶1 水含量(%)8.297.756.834.754.76 溶解时间(min)---2.51.5 漂移值10±210±310±210±210±2
2.3 卡氏滴定法间接测定妥布霉素水含量结论
用甲酰胺溶液中的水含量减去纯甲酰胺的水含量就能得到样品的水含量。甲酰胺水含量为0.043%，下式为样品水含量公式：
WC=WCsolWsol-WCforWforWsample(4)
式中WCsol为甲酰胺溶液的水含量，WCfor为纯甲酰胺水含量，Wsol为甲酰胺溶液的质量，Wfor为纯甲酰胺的质量，Wsample为测量样品的质量。间接测得妥布霉素水含量(4.75%)，与直接法测量的结果一致(4.76%)，但整个分析过程所需时间缩短至2min内，这是由于妥布霉素在纯甲酰胺中的溶解度较大，妥布霉素溶解速度加快。超声波具有空化效应和机械作用［10］，空化效应使溶液产生局部高温和高压，形成强大的冲击波，加速粒子的破碎和溶解。另外，超声波作用于液体时会产生激烈而快速变化的机械运动，加速溶质粒子与溶剂的碰撞，也将加速粒子的溶解。超声波的引入进一步加速了妥布霉素样品在溶剂中的溶解速度，样品完全溶解所需时间缩短至20s左右。与直接将样品投入滴定池相比，溶解时间节省了1～2min，因此整个分析过程所需时间也相应缩短。
3 结论
卡氏容量法最常用的滴定溶剂是甲醇，而妥布霉素固体颗粒只微溶于甲醇，样品的水分无法充分释放出来，因此用常规的卡氏容量法无法精确确定妥布霉素固体的水含量。通过向滴定溶剂中添加一定量的甲酰胺［甲酰胺∶甲醇(1∶3，V/V)］能显著提高妥布霉素在滴定溶剂中的溶解度，再通过卡氏容量法能精确测定其水含量。也可以在超声波的作用下，妥布霉素固体先溶于纯甲酰胺中，将妥布霉素固体样品转化为液体样品，再用卡氏容量法进行分析也能精确测定妥布霉素水含量。两种方法结果完全一致，说明两种方法都具有较高的精度。但后者比前者节省1～2min，具有快速，精确的特点。
这两种方法都无需添加任何辅助设备，也适用于其它在醇类溶剂中溶解度不高的氨基糖苷类物质中水含量的测定。
【文献】
［1］ 王弘，于淑娟. 妥布霉素结晶工艺的改进［J］. 医药杂志，2003，34(1)：13～14.
［2］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典1995年版二部［S］. 北京：化学工业出版社，2005：270.
［3］ 孟蓉，尚汝田. 卡尔费休法测定水分的及其在某些领域中的应用［J］. 化学试剂，2001，23(1)：39～41.
［4］ Isengard H D, Heinze P. Determination of total water and surface water in sugars ［J］. Food Chem,2003,82(1):169～172.
［5］ Ronkart S N, Paquot M, Fougnies C, et al. Determination of total water content in inulin using the volumetric Karl Fischer titration ［J］. Talanta,2006,70(5):1006～1010.
［6］ 季军宏，张永刚，彭菊芳. 卡尔费休容量法测定水性涂料中水分含量的影响因素［J］. 涂料工业，2004，34(6)：36～39
［7］ Scaccia S.Water determination in composite PEO?based polymer electrolytes by volumetric Karl Fischer titration method ［J］. Talanta,2005,67(4):678～681.
［8］ Schmitt K, Isengard H?D. Method for avoiding the interference of formamide with the Karl Fischer titration ［J］. Fresenius J Anal Chem,1997,357(7):806～811.
［9］ Wunsch G, Schoeffski K. Die Iodierende Nebenreaktion in Karl?Fischer?System ［J］. Anal Chim Acta,1990,239:283～290.
［10］ 席细平，马重芳，王伟. 超声波技术应用现状［J］. 山西化工，2007，27(1)：25～29.
