固相合成法制备环肽Hymenistatin?1及其含statine的类似物
【摘要】 目的 研究固相合成法制备Hymenistatin?1［HS?1，序列为cyclo?(?Pro?Pro?Tyr?Val?Pro?Leu?Ile?Ile?)］及其statine类似物的工艺步骤和影响因素。方法 采用Fmoc或Boc保护α?氨基，以HBTU/NMM为缩合剂进行直链肽接肽反应、以BOP/HOBt/DIEA为缩合剂进行环化固相合成HS?1及其类似物。用色谱仪和质谱仪对合成的环肽及其杂聚肽类似物进行纯化鉴定。结果 多肽合成收率可达65%，经反相高效液相色谱(RP?HPLC)柱对合成的多肽进行纯化后纯度均达到90%以上，通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪(MALDI?MS)检测所合成的环肽及环肽类似物的分子质量与理论分子质量相符。结论 成功合成出了较高纯度的目标多肽化合物。
【关键词】 固相多肽合成； HS?1； Statine类似物； 纯化
ABSTRACT Objective Preparation of Hymenistatin?1 ［HS?1, cyclo?(?Pro?Pro?Tyr?Val?Pro?Leu?Ile?Ile?)］ and its four statine?analogues by solid?phase peptide synthesis method, and the synthesis process and influencing factors were investigated. Methods Using the Fmoc? or Boc? protected α?amino acids, HBTU/NMM as coupling reagent (linear peptide synthesis) and BOP/HOBt/DIEA as cyclizing reagent, the cyclo?octapeptide HS?1 and its analogues were synthesized. The target peptides were purified by RP?HPLC and identified by MALDI?MS. Results The purity of the five peptides exceeded 90% and the yields up to 65%. The molecular weights of the synthesized peptides were identified by mass spectrogram. Conclusion The target peptide compounds with higher purity were synthesized.
KEY WORDS Solid?phase Peptide Synthesis; HS?1; Statine?analogues; Purification
Hymenistatin?1(HS?1)是由Pettit等［1］从太平洋Hymeniacidon海绵中分离得到的一种环八肽。肽链序列为：cyclo?(?Pro?Pro?Tyr?Val?Pro?Leu?Ile?Ile?)。有报道称HS?1在小鼠成淋巴细胞白血病P388的研究中具有抑制细胞生长的作用，但结果并没有在后续的研究中得到充分证实［2］。
Cebrat等［3］揭示了H?1具有抑制体液和细胞免疫反应的免疫抑制作用。 Poojary等［4］合成的HS?1显示出对细菌生长的抑制作用，但对真菌的抑制作用不强；HS?1的驱虫作用不大，但表现出一定的抗炎症作用。Zubrzak等［5］用1，5?二取代四唑环修饰HS?1之后，修饰物的免疫抑制活性变化不大。
Statine是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG?CoA，胆固醇合成限速酶)的竞争性抑制剂，具有多种免疫调节作用和细胞效应，且不依赖于血液胆固醇的降低。 有研究表明， statine不但可以抑制IFN?γ刺激诱导的人巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的MHC?II抗原的表达［6］，还可以选择性阻断整合素β2、白细胞功能抗原?1(LFA?1，即CD11a/CD18)的表达［7］。这些功能与statine对HMG?CoA的抑制作用无关，提示statine也是一种潜在的免疫抑制剂。天然HS?1的生物学活性较弱，不能作为免疫抑制剂应用。本文研究拟采用statine对HS?1进行修饰，以期能够有效提高HS?1的免疫抑制活性。
天然HS?1结构中的氨基酸残基都是疏水性氨基酸，并且是环状结构，致使化学合成极其困难。为此，本文还希望通过修饰降低HS?1的疏水性，提高HS?1在水溶液中的溶解性。下面报道HS?1及4个新化合物的设计、固相合成与分离纯化方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
多肽合成仪(CS536，美国CSBio公司)，半制备型高效液相色谱仪(Waters Delta Prep4000，美国Waters公司)，分析型高效液相色谱仪(Agilent 1100，美国Agilent公司)，冷冻干燥机(Christ Alpha，德国Christ公司)，激光解吸电离飞行时间质谱仪(LCQ Deca，美国Thermo?Finnigan公司)，紫外分光光度计(Beckman DU7400，美国Beckman公司)，C18反相分析柱(Sepax GP?C18，5μm，120?，4.6mm×150mm)。
实验所用Fmoc?Pro?Merrifield Resin(取代值0.291mmol/g，交联度1%，100～200目)、Boc?Val?Wang Resin(取代值0.523mmol/g，交联度1%，100～200目)、Fmoc?Pro?CTC Resin(取代值0.42mmol/g，交联度1%，100～200目)、Boc?Tyr(tBu)?OH、Boc?Pro?OH、Boc?Ile?OH、Boc?Leu?OH、Fmoc?Tyr(tBu)?OH、Fmoc?Pro?OH、Fmoc?Ile?OH、Fmoc?Leu?OH、Boc?statine(3s，4s)?OH、HATU［O?(7?偶氮苯并三氮唑?1?氧)?N，N，N′，N′?四甲基脲六氟磷酸酯］、HBTU(苯并三唑?1?四甲基六氟磷酸酯)、HOBt(N?羟基苯并三唑)、BOP(邻苯二甲酰丁辛酯)、DIEA(N，N?二异丙基乙胺;二异丙基乙胺)、TFA(三氟乙酸)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲亚砜)、DCM(二氯甲烷)、ACN(乙腈)、EDC［1?乙基?3?(3?二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐］、NMM(N?甲基吗啉)和苯甲硫醚均由杭州中肽生化有限公司提供，哌啶经重蒸后使用，水为二次去离子水。
1.2 HS?1及其类似物的化学合成
本文所合成的5种环肽序列分别为：
HS?1：cyclo?(?Ile1?Ile2?Pro3?Pro4?Tyr5?Val6?Pro7?
Leu8?)；
A1HS1：cyclo?(?Ile1?Ile2?statine3?Pro4?Tyr5?Val6?
Pro7?Leu8?)；
A2HS1：cyclo?(?Ile1?Ile2?Pro3?statine4?Tyr5?Val6?
Pro7?Leu8?)；
A3HS1：cyclo?(?Ile1?Ile2?Pro3?Pro4?Tyr5?Val6?
statine7?Leu8?)；
A4HS1：cyclo?(?Ile1?Ile2?statine3?statine4?Tyr5?
Val6?Pro7?Leu8?)。
虽然这5种环肽或环肽类似物的序列如上面所表示的非常相似，并且按照顺序给每个氨基酸残基做了编号，但考虑到每个化合物的疏水性和空间位阻可能并不完全相同，加之合成的线性肽链终究要环化成环肽，因此，为了方便、有效地合成目的产物，我们选择接肽反应的第一个氨基酸也不尽相同。
(1)HS?1的合成路线与纯化
树脂溶胀 调用自编程序Method1，树脂溶胀的具体方法是将Fmoc?Pro?CTC Resin 4.76g(合成规模为2.0mmol)用200ml DMF浸泡30min，使之充分溶胀，然后抽干。
脱除氨基保护基 调用自编程序Method2，具体方法为加入含20%哌啶的DMF溶液20ml，搅拌反应30min，再抽干。然后用DMF洗涤5次，以除去残留的脱保护试剂。手工取样，茚三酮检测，若树脂呈深蓝色，则表明Fmoc保护基已经脱除。
接肽反应 调用自编程序Method3，具体方法是在反应器中加入溶解有3.33g Fmoc?Val?OH的200ml DMF溶液，机械搅拌2min，然后加入HBTU 3.57g，最后加入NMM 2.02g［AA∶HBTU∶NMM(mol/mol)=3∶2.85∶6］，反应30min。抽干，用DMF洗涤3次，然后用甲醇洗涤树脂，以除去氨基酸溶液和DMF，以便手工进行茚三酮检测，检测结果若树脂呈现无色，则说明反应比较完全。依次调用程序Method2和Method3，按肽链的氨基酸序列依次用Fmoc?Tyr(2?Br?Z)?OH、Fmoc?Pro?OH、Fmoc?Pro?OH等重复以上接肽反应，直至最终合成出所需肽链。合成顺序为：Pro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu。各氨基酸的投料比、接肽反应时间和脱保护基时间如表1所示。
后续类似物的合成中，表1所列参数基本不变。Boc?statine?OH的投料比为2，接肽反应时间为40min，脱保护基时间为30min。
肽链的切割 将合成肽链用切割液［TFA∶TIS(triisopropylsilane)∶H2O=95.0∶2.5∶2.5］在低于20℃的条件下切割，反应时间为2.5h，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，4000表1 HS?1合成中各氨基酸投料比、接肽反应时间r/min离心3min，真空干燥12h，得线性肽链的粗品约1.5g。
肽链的环化 将线性多肽粗品1.4g用200ml DMF溶解，依次加入EDC(2eq，0.6g)、BOP(1eq，0.7g)、HOBt(2eq，0.42g)和DIEA(5eq，1.1g)，过夜环化。加入EDC可以加速缩合反应。蒸干DMF，得环肽粗品1.35g，粗品用MALDI?TOF质谱仪进行分析鉴定。
环肽粗品的纯化 将上述环化粗品肽溶于适量DMSO中(由于此肽的水溶性不好，上样浓度要严格控制在小于1mg/ml)，上样样品用5μm的滤纸过滤。制备色谱柱为Waters X?Bridge C18、5μm反相柱；洗脱液：A液为0.1% TFA的水溶液，B液为含0.1% TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。采用60min内B液由30%～65%的线性梯度洗脱方式，流速为38ml/min。收集纯度高于95%的馏分。最后冷冻干燥，得100mg纯度大于90%的最终产品。
分析型HPLC检测纯度 色谱柱为SepaxGP?C18反相柱(4.6mm×150mm，5μm，120?)；洗脱液：A液为0.1% TFA的水溶液，B液为含0.1% TFA的乙腈水溶液；检测波长220nm。采用20min内B液由60%～80%的线性梯度洗脱方式，流速为1.0ml/min。
MS鉴定 激光解吸电离飞行时间质谱仪检测目标产物的分子量。
(2)A1HS1的合成路线与纯化 与HS?1的合成略有不同，在A1HS1的合成中，合成方法主要有以下几点变化：①树脂改为Fmoc?Pro?Merrifield Resin；②氨基酸为Boc保护；③每连接一个氨基酸残基，要用50% TFA/DCM将肽链切割下来，然后脱保护、洗涤、活化树脂，再连下一个氨基酸残基，最后从树脂上将肽链切割下来的切割液为HF，时间1.2h；④纯化时梯度洗脱条件为B液：70%～100%；⑤HPLC分析时B液：61%～81%；⑥合成顺序为：Pro，Val，Tyr，Pro，statine，Ile，Ile，Leu。其余同HS?1合成。冷冻干燥后得250mg纯度大于93%的最终产品。由于溶解度比HS?1好，故收率较高。
(3)A2HS1的合成路线与纯化 类似于A1HS1的合成，同HS?1的合成相比较，在A2HS1合成中：①树脂为Fmoc?Pro?CTC Resin；②氨基酸为Fmoc保护；③最后切割液为F液，时间2.5h；④纯化时梯度洗脱条件为B液：65%～90%；⑤HPLC分析时B液：60%～80%；⑥合成顺序为：Pro，Ile，Ile，Leu，Pro，Val，Tyr，statine；⑦因statine是用Boc保护，因此在连接statine后，要将肽链片段先从树脂上切割下来，然后脱保护、洗涤、树脂活化，再连下一个残基。其余同HS?1合成。冷冻干燥后得268mg纯度大于92%的最终产品。由于溶解度比HS?1好，故收率较高。
(4)A3HS1的合成路线与纯化 类似于A1HS1的合成，同HS?1的合成相比较，在A3HS1合成中：①树脂为Fmoc?Val?Wang Resin；②氨基酸为Fmoc保护；③切割液为F液，时间2.5h；④纯化时梯度洗脱条件为B液：43%～85%；⑤HPLC分析时B液：50%～70%；⑥合成顺序为：Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu，statine；⑦因statine是用Boc保护，因此在连接statine后，要将肽链片段先从树脂上切割下来，然后脱保护、洗涤、树脂活化，再连下一个残基。其余同HS?1合成。冷冻干燥后得245mg纯度大于98%的最终产品。由于溶解度比HS?1好，故收率较高。
(5)A4HS1的合成路线与纯化 类似于A1HS1的合成，同HS?1的合成相比较，在A4HS1合成中：①树脂为Fmoc?Pro?Merrifield Resin；②氨基酸为Boc保护；③每连接一个氨基酸残基，要用50% TFA/DCM切割，然后洗涤，再连下一个氨基酸残基，最后从树脂上将肽链切割下来，切割液为HF，时间1.2h；④纯化时梯度洗脱条件为B液：62%～80%；⑤HPLC分析时B液：62%～82%；⑥合成顺序为：Pro，Val，Tyr，statine，statine，Ile，Ile，Leu；⑦因statine是用Boc保护，因此在连接statine后，要将肽链片段先从树脂上切割下来，然后脱保护、洗涤、树脂活化，再连下一个残基。其余同HS?1合成。冷冻干燥后得215mg纯度大于90%的最终产品。由于溶解度比HS?1好，故收率较高。
2 结果与讨论
2.1 目标产物的合成
(1)环肽的代谢稳定性和生物利用度一般远高于直链肽［8］，但环肽的化学合成往往比较困难，尤其是首尾相连的环肽合成难度更大。本试验研究的5种肽或杂聚肽都是首尾相接的环肽，而且8个氨基酸残基都是疏水性氨基酸，给合成造成困难，也使得纯化更加不易。
(2)常规的固相合成中需要特殊的固相支持物。当用普通的Fmoc固相支持物时，在二肽阶段，由于环化引起的损失非常高，有些情况甚至导致所有肽链从固相支持物上损失，特别是若C端为氨基化Pro时。但Boc法则可以避免这类副反应。因此本研究中所采用的几种不同的树脂，即当C端为氨基化Pro时，采用Merrifield Resin，C端为其它氨基化氨基酸时，采用Wang Resin和CTC Resin。选择具有稳定的理化性质、足够多的反应位点及副反应少等优点的树脂，可以提高产物收率，降低纯化成本。
(3)本研究以HBTU/NMM(合成线性肽链)和BOP/HOBt/DIEA(环化时)作为复合型缩合试剂，NMH或DIEA提供反应所需碱性环境(后者碱性强于前者)。加入5倍量的DIEA目的是加快缩合速率，并提高产品收率。
2.2 合成肽的纯化及纯化后的色谱分析
纯化时以TFA为交换离子对、以含0.1% TFA的乙腈水溶液为洗脱液、采用线性梯度洗脱方式对目标肽进行纯化。纯化后的色谱分析结果显示，主峰面积较大，主峰旁无相似的峰，其它杂质峰面积相比于主峰面积要小得多，表明合成的粗品经反相高效液相色谱纯化后，目标肽的纯度得到了很大地提高(图略)。
2.3 合成肽纯化后的质谱鉴定
MALDI?MS分析的结果显示，HS?1、A4HS?1的实际分子质量与理论分子质量相一致。A1HS1、A2HS1和A3HS1的实际分子量数值比理论值高一个单位，可能由于纯化过程中使用了TFA，肽能与TFA成盐造成。另外，质谱图中峰数较少，且主峰明显，说明合成的目标肽经色谱柱纯化后，可以除去大部分的杂质，从而得到较纯的目标肽(图略)。本研究中合成的5种肽分子量及纯度见表2。
3 结论
本实验采用固相合成法制备HS?1及含statine的4种类似物，经质谱仪分析检测，验证了合成产物的正确性。产物经RP?HPLC纯化，纯度均达到90%以上，表2 本文合成的HS?1及其类似物MS检测的分子量及纯度产品理化性质稳定，为下一步生物活性检测奠定了基础。
【】
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