HPLC同时测定血浆中头孢氨苄和甲氧苄啶的浓度

                       作者：夏登宁 夏艳姣 尹佳 贺英菊

【摘要】  采用高效液相色谱紫外检测器同时检测血浆中头孢氨苄和甲氧苄啶的浓度。以0.5倍血浆体积，浓度为10%(v/v)的高氯酸为蛋白沉淀剂。色谱条件：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，流动相：pH3.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液∶乙腈∶甲醇(76∶16∶8)，流速1.0ml/min，进样量20μl，检测波长240nm。头孢氨苄、甲氧苄啶及内源性物质分离良好。头孢氨苄血药浓度线性范围为0.5～50.0μg/ml，检测限为50ng/ml，高、中、低浓度的相对回收率在97.3%～100.5%之间(n=5)，日内RSD≤6.5%(n=5)，日间RSD≤8.3%(n=5)。甲氧苄啶血药浓度线性范围为0.25～25.0μg/ml，检测限为25ng/ml，高、中、低浓度的相对回收率在96.5%～99.3%之间(n=5)，日内RSD≤6.9%(n=5)，日间RSD≤8.6%(n=5)。本法样品处理简单、灵敏、准确，适合于同时测定两者的体内浓度。

【关键词】  头孢氨苄； 甲氧苄啶； 血药浓度； 高效液相色谱法。

    ABSTRACT  To establish an HPLC method for the simultanecous determination of cefalexin and trimethoprin in rabbits′ plasma. The protein was precipitated by perchloric acid. Chromatographic separation of analytes was achieved on a C18 column at the temperature of 30℃, using a mixture of 0.05mol/L PBS (pH=3.0), acetonirile and methanol (76∶16∶8, v/v/v) as mobile phase and detection was performed at 240 nm. The linearity was obtained over the concentration range of 0.5～50.0μg/ml for cefalexin and 0.25～25.0μg/ml for trimethoprim. The relative recoveries of cefalexin and trimethoprim at high, medium and low concentrations were 97.3%～100.5% and 96.5%～99.3% respectively. Both inter?and intra?day RSD (n=5) were ≤8.3% for cefalexin and ≤8.6% for trimethoprim. The limits of detection for cefalexin and trimethoprim were 50ng/ml and 25ng/ml respectively. The present HPLC method is simple, sensitive, accurate, and was successfully applied to the simultaneous determination of cefalexin and trimethoprim in rabbits′ plasma.

    KEY WORDS  Cefalexin;  Trimethoprim;  Plasma drug concentration;  HPLC

     头孢氨苄为口服头孢菌素类药物，作用机制主要是通过干扰细菌细胞壁主要成分肽聚糖的合成发挥抗菌作用。甲氧苄啶作用机制为干扰细菌的叶酸代谢，选择性抑制细菌的二氢叶酸还原酶的活性，使二氢叶酸不能还原为四氢叶酸，阻止细菌核酸和蛋白质的合成。头孢氨苄与甲氧苄啶联用(5∶1)能扩大抗菌谱，提高抗菌活性［1］，现有相应产品上市。国内外有较多的报道了高效液相紫外检测器检测头孢氨苄的血药浓度［2，3］，和使用紫外检测器［4］、质谱检测器［5］、高效毛细管电泳法［6］检测甲氧苄啶的血药浓度。由于两者的物理化学性质差异较大，以及生物样品内源物质干扰较多，高效液相色谱紫外检测器同时测定两者血药浓度有一定的困难，国内外文献报道较少。本实验采用外标法，建立了一个简单、灵敏、准确，可同时测定两者血药浓度的方法。

    1  材料与方法

    1.1  仪器与试药

    高效液相色谱仪：LC?10ATvp泵，SPD?10Avp紫外可见光检测器(日本岛津)，天平BP211D(德国Sartorius公司)，pHS?2C型酸度计(成都方舟科技开发公司)。

    头孢氨苄(山东淄博新华肯孚制药有限公司，批号010511?00223)，甲氧苄啶(广州侨光制药有限公司，批号50010)，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，超纯水(自制)，其它试剂均为分析纯。头孢氨苄/甲氧苄啶胶囊(长春市新安药业有限公司，批号070201)。

    1.2  色谱条件

    色谱柱：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)(Dikima公司)，柱温30℃，流动相为pH3.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液∶乙腈∶甲醇(76∶16∶8)，流速1.0ml/min，进样量20μl，检测波长240nm。

    1.3  标准曲线及线性关系

    精密称取头孢氨苄20mg，甲氧苄啶10mg，混合，先用0.1mol/L的乙酸2ml使其快速溶解，再以10%(v/v)高氯酸为溶剂定容，逐级稀释法配制6个不同浓度的标准储备液。取6份100μl空白血浆，分别加入上述标准储备液50μl，涡旋1min后12000r/min离心5min。制得的样品中分别含头孢氨苄0.5、1.0、5.0、10.0、25.0和50.0μg/ml，甲氧苄啶0.25、0.5、2.5、5.0、12.5和25.0μg/ml。取上清液进样，记录峰面积(A)，以浓度(C)对峰面积进行线性回归，得头孢氨苄标准曲线为A=10049C-1420  R2=0.9996，线性范围为0.50～50.0μg/ml；甲氧苄啶标准曲线为A=29599C-1501，R2=0.9995，线性范围为0.25～25.0 μg/ml。两者线性关系良好。

    1.4  血浆样品的处理

    给药前、后于兔耳缘静脉处取血0.5ml，12000r/min离心5min，吸取血浆100μl，加入10%的高氯酸50μl，涡旋1min后12000r/min再离心5min，样品置4℃冰箱保存待测。

    2  结果

    2.1  色谱行为

    按1.3项下制备标准曲线，按1.4项下处理样品，按1.2项下色谱条件进样测定，得空白血浆、空白血浆加对照品、服药后血浆的色谱图(图1)。由图1可见血浆中的内源性杂质不干扰头孢氨苄和甲氧苄啶的测定，两者分离良好。头孢氨苄保留时间约5.3min，甲氧苄啶保留时间约6.6min。

    2.2  方法学研究

    (1)检测限  分别制备不同浓度的头孢氨苄和甲氧苄啶低浓度血浆样品，各重复3次，测得峰高与噪音，取信噪比为3，得头孢氨苄的最低检测浓度为50ng/ml，甲氧苄啶的最低检测浓度为25ng/ml。

    (2)精密度  取空白血浆数份，按标准曲线样品制备方法配制高、中、低3种浓度的质控样品(分别含头孢氨苄50.0、10.0和0.5μg/ml，甲氧苄啶25.0、5.0和0.25μg/ml)。测得头孢氨苄高、中、低浓度的日内RSD(n=5)分别为1.9%、5.2%和6.5%；日间RSD(n=5)分别为7.9%、5.8%和8.3%。甲氧苄啶高、中、低浓度的日内RSD(n=5)分别为3.5%、3.6%和6.9%；日间RSD分别为8.6%、2.8%和5.3%(n=5)。

    (3)回收率  同法配制高、中、低3种浓度的质控样品，每个浓度5份，由标准曲线回归方程检出量评价本法的回收率。结果头孢氨苄高、中、低浓度的相对回收率分别为100.5%、97.3%和98.5%；甲氧苄啶高、中、低浓度的相对回收率分别为98.7%、99.3%和96.5%。

    (4)血浆样品稳定性考察  取质控样品分别置于室温、4℃条件下储存，于0、0.5、1.5、2.5、3.0和5.0d测定，分别计算两者峰面积的RSD。室温下两者的RSD在19.0%～105.4%之间，峰面积都有下降的趋势；4℃下两者的RSD在3.3%～7.9%之间，RSD小于10%，表明4℃下存放5d两者基本保持稳定。

    2.3  头孢氨苄和甲氧苄啶在兔体内的血药浓度

    6只健康新西兰大耳兔，雌、雄各半，体重范围2.5～2.8kg。实验前禁食12h，口服头孢氨苄/甲氧苄啶胶囊两粒(每粒含头孢氨苄125mg，甲氧苄啶25mg)，4h后统一进食。分别于0、0.5、0.67、0.83、1.0，1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0和10.0h取耳缘静脉血0.5ml，置肝素化离心管中，按1.4项下处理，立即放入4℃冰箱冷藏，测定。平均药?时曲线见图2。

    3  讨论

    头孢氨苄为弱酸性化合物，甲氧苄啶为弱碱性化合物，两者物理化学性质相差较大，再加上生物样品内源性物质干扰多，给分析带来困难。报道［7］，采用C18色谱柱，2mg/ml的诺氟沙星为内标，流动相为pH3.5的2mol/L甲酸?甲酸钠缓冲液∶甲醇∶乙腈(22∶7∶7)，内含0.002mol/L的SDS为离子对试剂，检测波长240nm。易造成基线漂移，平衡时间长，且每        1：头孢氨苄；  2：甲氧苄啶；  3：诺氟沙星(文献7报道的内标)。    A：空白血浆；  B：空白血浆+头孢氨苄+甲氧苄啶

    (0.5倍体积10%的高氯酸为蛋白沉淀剂)；  C：给药后血浆样品；  D：空白血浆+头孢氨苄+甲氧苄啶(1倍体积的乙腈

    为蛋白沉淀剂)；  E：空白血浆+头孢氨苄+甲氧苄啶+诺氟沙星(0.5倍体积10%的高氯酸为蛋白沉淀剂)

    图1    样品的HPLC色谱图

    图2    单剂量口服头孢氨苄(A)/甲氧苄啶(B)兔体内平均血药浓度－时间曲线图

    个样品运行时间长达15min。在检测波长240nm下，检测器对诺氟沙星响应低，峰形展宽严重。作者采用pH3.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液∶乙腈∶甲醇(76∶16∶8)为流动相，基线平衡快，但内标峰形仍未见改善(见图1E)，故采用外标法。

    作者还考察了流动相的pH值和组成对分离度及峰形的影响，发现pH值对分离度影响较大，偏酸性条件下，pH值升高，越易于分离，但两者拖尾越来越严重。pH3.0时能达到基线分离，拖尾最小。流动相中甲醇的比例升高，甲氧苄啶保留时间的变化大于头孢氨苄，说明甲氧苄啶比头孢氨苄对甲醇更加敏感。还考察了甲酸?甲酸钠、乙酸?乙酸钠、不同浓度的磷酸盐缓冲液对拖尾的影响，发现使用0.05mol/L的磷酸盐缓冲液峰拖尾最小，最终确定了本实验的色谱条件(色谱图见图1A、图1B和图1C)。

    同时还考察了不同蛋白沉淀剂对峰形的影响。发现使用1倍体积的乙腈［7］、3倍体积的甲醇，峰形展宽严重，柱效不高(图1D)；0.5倍体积10%的三氯乙酸溶剂峰很大，干扰主峰；而使用0.5倍体积10%的高氯酸，蛋白沉淀效果好，不仅可以防止峰形展宽，提高了柱效，而且可以降低对样品的稀释作用。

【文献】
  ［1］ 刘健，钟巍，康子胜，等. 甲氧苄氨嘧啶与头孢氨苄体外联合抗菌作用［J］. 临床药杂志，2003，19(1)：17～22.

［2］ 罗楠，刘放南，万秀珍，等. 反相高效液相色谱法测定大鼠头孢氨苄血药浓度［J］. 医学研究生学报，2006，19(9)：783～785.

［3］ Samanidou V F, Hapeshi E A, Papadoyannis I N. Rapid and sensitive high performance liquid chromatographic determination of four cephalosporin antibiotics in pharmaceuticals and body fluids ［J］. J Chromatogr B,2003,788(1):147～158.

［4］ Hruska M W, Frye R F. Determination of trimethoprim in low?volume human plasma by liquid chromatography ［J］. J Chromatogr B,2004,807(2):301～305.

［5］ Croubels S, Baere S D, Backer P D. Comparison of a liquid chromatographic method with ultraviolet and ion?trap tandem mass spectrometric detection for the simultaneous determination of sulfadiazine and trimethoprim in plasma from dogs ［J］. J Chromatogr B, Biomed Sci Appl,2003,788(1):167～178.

［6］ 杜斌，张振中，张秋荣，等. 高效毛细管电泳法同时测定血浆中头孢羟氨苄和甲氧苄啶的含量［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(6)：344～346.

［7］ Qi M L, Wang P, Sun P, et al. Liquid chromatographic method for the simultaneous determination of cefalexin and trimethoprim in dog plasma and application to the pharmacokinetic studies of a coformulated preparation ［J］. J Chromatogr B,2006,832(2):307～312.