泵抑制剂对鲍曼不动杆菌诱导突变株氟喹诺酮敏感性的影响

【摘要】  目的 探讨主动外排泵在鲍曼不动杆菌诱导突变株对氟喹诺酮类药物敏感性的影响。方法 用环丙沙星诱导鲍曼不动杆菌筛选突变株。采用琼脂二倍稀释法检测泵抑制剂羰基氰氯苯腙(carbonylcyanide?m?chlorophenyl?hydrazone，CCCP)或利舍平存在时鲍曼不动杆菌诱导突变株对环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星敏感性的变化。结果 CCCP和利舍平能影响部分鲍曼不动杆菌突变株对3种氟喹诺酮的最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration，MIC)，使MIC降至原值的1/4以下，泵阳性株在对3种氟喹诺酮均敏感的突变株中即存在。结论 主动外排泵表达增强可能是鲍曼不动杆菌突变株MIC值升高的原因之一

【关键词】  鲍曼不动杆菌； 氟喹诺酮； 主动外排泵； 泵抑制剂

    ABSTRACT  Objective  To investigate the role of efflux pump of Acinetobacter baumannii mutant strains against fluoroquinolones.  Methods  The mutant strains of Acinetobacter baumannii separated from clinical sample were selected by ciprofloxacin. The antibiotic activities of ciprofloxacin, levofloxacin and gatifloxacin were detected by 2?fold agar dilution method with or without efflux pump inhibitors, carbonylcyanide?m?chlorophenyl?hydrazone (CCCP) or reserpine.  Results  CCCP and reserpine could reduce the minimum inhibition concentration (MIC) to below 1/4 of former in some of the mutant strains against fluoroquinolones. Positive efflux pump strains existed in mutant strains which were susceptible to them.  Conclusion  The excessive expression of efflux pump was related to the higher MIC in mutant strains of Acinetobacter baumannii.

    KEY WORDS  Acinetobacter baumannii;  Fluoroquinolone;  Efflux pump;  Efflux pump inhibitor

    鲍曼不动杆菌日益成为院内感染的重要病原菌之一，其广泛的耐药性越来越引起人们的关注［1］。鲍曼不动杆菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性在很大程度上与氟喹诺酮类药物广泛及不合理使用所造成的强选择压力有关。泵抑制剂可以提高氟喹诺类药物对不同致病菌的抗菌活性国内已有报道［2～4］。本文应用环丙沙星诱导的鲍曼不动杆菌突变株，研究其对氟喹诺酮产生耐药突变过程中泵抑制剂的作用。

    1  材料与方法

    1.1  菌株

    来源于医科大学附属盛京临床微生物室保存的临床分离株。依据美国临床实验室标准化研究所CLSI 2006年标准，根据纸片扩散法结果，选取一株对临床常用抗菌药物均敏感的菌株作为诱导突变的实验菌株。该菌株经法国Bio?Merieux公司的API系统鉴定确证为鲍曼不动杆菌。

    1.2  试剂及仪器

    环丙沙星(批号130451?200302，含量84.9%)、左氧氟沙星(批号130455?200202，含量97.2%)和加替沙星(批号130518?200402，含量97.2%)标准品购于中国药品生物制品检定所；CCCP、利舍平标准品购自Sigma公司；Mueller?Hinton(MH)琼脂培养基为美国Difco公司产品。SHP?250型生化培养箱(上海京宏实验设备有限公司)，比浊仪(美国Becton Dickinson公司)。

    1.3  MIC测定

    采用CLSI标准琼脂平板二倍稀释法，测定环丙沙星、左氧氟沙星及加替沙星三种氟喹诺酮药物对各实验菌株的MIC。各实验菌株在MH琼脂平板上接种，37℃孵育过夜，挑取单个菌落以生理盐水稀释至浓度为1.5×108CFU/ml，再将该菌悬液稀释100倍，之后取10μl点接种于含不同浓度氟喹诺酮类药物的MH琼脂平板上，35℃培养20h，观察细菌生长情况。药敏结果根据CLSI 2006年标准判读(环丙沙星：敏感≤1μg/ml，耐药≥4μg/ml；左氧氟沙星和加替沙星敏感≤2μg/ml，耐药≥8μg/ml)。选择铜绿假单胞菌ATCC27853为质控菌株。

    1.4  环丙沙星诱导突变株的筛选

    参照崔俊昌等报道［5］，将筛选的敏感株接种于MH琼脂平板，37℃培养16～18h，取单菌落，配制成浓度为1.5×108CFU/ml的菌悬液，取100μl菌悬液接种在含有2×MIC和4×MIC浓度环丙沙星的MH琼脂平板上，以玻璃棒均匀涂抹，37℃培养24～72h。选取典型菌落，接种于不含药的MH琼脂平板，传代1次，再接种于原药物浓度的MH琼脂平板，以确定筛选株为突变株。共筛选出10株突变株，编码为2C1、2C2、2C3、2C4、2C5、2C6、4C1、4C2、4C3和4C4。

    1.5  泵抑制剂对菌株MIC的影响

    在含氟喹诺酮类药物二倍稀释浓度的MH琼脂平皿中加入CCCP至5mg/L，或加入利舍平至20mg/L。测定泵抑制剂存在的情况下氟喹诺酮类药物对鲍曼不动杆菌诱导突变株的MIC，同时制备仅含泵抑制剂的培养基作为生长对照。比较应用泵抑制剂前后菌株对抗菌药物MIC的变化，MIC值降至原值的1/4或更低判定为外排泵阳性株。

    2  结果

    2.1  敏感株和诱导突变株对环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星的MIC

    经含有环丙沙星的MH琼脂平板筛选出的突变株的MIC比诱导前升高了8～64倍，与CLSI 2006年标准中环丙沙星的药敏范围比较，有2株对环丙沙星中介，编号为2C6和4C3；1株对环丙沙星耐药，编号为4C4。对左氧氟沙星及加替沙星的MIC值也分别升高了4～32倍，但各实验菌株对左氧氟沙星和加替沙星均敏感(表1)。

    2.2  泵抑制剂加入后对诱导突变株MIC的影响

    加入泵抑制剂后临床筛选的敏感株MIC值没有明显变化，由其筛选出的10株突变株的MIC值都有不同程度的降低，其中有7株MIC值降低至原值的1/4或更低，即为外排泵阳性株，占诱导株的70%(表1)。加入利舍平后有7株外排泵阳性株，加入CCCP后有6株外排泵阳性株。在环丙沙星的单药和加入泵抑制剂后MIC值比较可以看出，有2株菌为仅与利舍平有关的外排泵阳性株，分别是2C6和4C3。在左氧氟沙星的单药和加入泵抑制剂后MIC值比较中有1株菌为仅与CCCP有关的外排泵阳性株，编号为2C6。在加替沙星的单药和加入泵抑制剂后MIC值比较，5株泵抑制剂阳性株的MIC值下降与两种泵抑制剂都有关。对环丙沙星中介的2C6，利舍平仅降低环丙沙星的MIC值至原值的1/16，对左氧氟沙星和加替沙星没有作用，但CCCP却能降低左氧氟沙星的MIC值至原浓度的1/8，对另外两种药物没有作用。另外1株4C3，利舍平仅降低环丙沙星的MIC值至原值的1/4，对另外两种药物没有作用，而且CCCP没有筛选出外排泵阳性株。本实验筛选出的耐药株4C4对两种泵抑制剂来说都不是外排泵阳性株。 表1  外排泵对鲍曼不动杆菌诱导突变MIC的影响

    3  讨论

    鲍曼不动杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要分为两类：①靶位点的改变，即DNA促旋酶或拓扑异构酶活性位点的改变，降低了与氟喹诺酮类的亲和力；②细胞内药物浓度降低，即内源性主动外排系统表达增强使药物的外排增加，或者膜孔蛋白改变降低药物的内流。其中主动外排系统是细菌抵御外界不良环境的重要手段，是一些致病菌内源性和获得性多重耐药的重要原因［6］。鲍曼不动杆菌中存在着铜绿假单胞菌MexAB?OprM样外排系统，由adeABC转座子编码，可排出氟喹诺酮类、氨基糖苷类和多种其它抗生素［7］。主动外排泵抑制剂CCCP是一种抑制质子转运的解偶联剂，可以抑制主动外排系统能量来源的质子浓度梯度，使药物在细菌体内的蓄积量增加，恢复细菌对药物的敏感性，但毒性较大。另一种外排泵抑制剂利舍平为某些外排泵的底物，可竞争性抑制外排泵对抗生素的排出，两者是目前研究比较广泛的外排泵抑制剂［8，9］。

    本研究中，加用CCCP或利舍平后部分鲍曼不动杆菌诱导突变株对环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星的敏感性进一步增加，说明CCCP和利舍平均能抑制部分突变株对氟喹诺酮类药物的排出。在我们的实验中外排泵阳性株主要集中在对环丙沙星的MIC在1μg/ml的诱导突变株，这些突变株对三种氟喹诺酮均敏感，提示在鲍曼不动杆菌由敏感株向耐药株转变的过程中既有外排泵表达增强，抗生素的应用可能是导致外排泵表达增强的诱因之一。在以往的报道中多以临床分离的耐药菌株为研究对象，结论证明外排泵表达增强是鲍曼不动杆菌的耐药机制之一［10，11］。在我们的实验中，环丙沙星耐药的突变株4C4虽然泵抑制剂的应用使其对三种氟喹诺酮药物的MIC值有所降低，但仅降低1/2，并不提示有外排泵表达增强参与其耐药性的产生，其耐药的变化可能是由于如环丙沙星作用靶位的变化等引起的，由于本实验中筛选出的耐药菌株较少，这种结果只能说明泵抑制剂表达增加不一定参与鲍曼不动杆菌的耐药。

    本研究还发现，虽然CCCP和利舍平同为主动外排泵的抑制剂，但其抑制作用有所不同，两种抑制剂并未完全呈现同步抑制作用。有些菌株CCCP抑制作用为阳性，而利舍平为阴性，反之亦然，如2C6和4C3。在鲍曼不动杆菌的相关研究中未见报道，但该结果与Vadezate等提出的嗜麦芽寡养单胞菌可能存在不同的主动外排泵，不同泵抑制剂的作用可能有所不同的结论相一致［12］。另外，我们还发现2C1对左氧氟沙星和加替沙星是外排泵阳性株，但对环丙沙星并不是如此；对于突变株2C6利舍平仅降低环丙沙星的外排，CCCP则只降低左氧氟沙星的外排，两者对加替沙星没有作用。分析原因可能是抗菌药物结构的差异所造成的疏水性等生化特点的不同，使外排泵对其排出的能力不同。

    我们的实验应用环丙沙星诱导鲍曼不动杆菌突变，发现突变株对左氧氟沙星和加替沙星的MIC值升高，而且在应用泵抑制剂后对左氧氟沙星和加替沙星也有外排泵阳性株出现，说明鲍曼不动杆菌在对氟喹诺酮耐药的过程中存在着交叉耐药的情况。

    综上所述，通过本实验室诱导突变株的外排泵表达增强，泵抑制剂CCCP或利舍平均能抑制外排泵对氟喹诺酮药物的泵出。但氟喹诺酮存在交叉耐药，临床上一旦出现细菌对某种氟喹诺酮耐药，就应避免选择其它同类药物。因此，从药物研发的角度寻求更加有效且安全无毒的外排泵抑制剂，将其与氟喹诺酮类药物联合应用，可能会克服或减少某些菌类的耐药现象，达到临床有效的目的。

【】
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