放线菌SPRI?70014杀草成分的研究

                作者：顾学斌 徐文平 叶高艺 张育雷 倪玮玮 陶黎明

【摘要】  一株来源于江西土壤代号为SPRI?70014的放线菌发酵产物具有很强的杀草活性，本文采用溶剂萃取、硅胶柱层析及制备HPLC等手段对该菌株发酵产物的活性组分进行了活性跟踪分离，得到纯度大于98%化合物纯品，通过理化性质及波谱学分析，鉴定其结构为2?［2?(3，5二甲基?2?氧?环己基)?6?氧?四氢吡喃?4?基］?乙酰胺。并用除草剂生测标准化操作法(SOP)初步评价了该化合物除草活性。

【关键词】  放线菌； 次级代谢物； 乙酰胺； 杀草活性

    ABSTRACT  To explore the herbicidal active component in fermentation of a soil actinomycete SPRI?70014, a compound was isolated and purified by using solvent extraction, silica gel column chromatography and preparative HPLC. The separation procedure was traced by herbicidal activity. By means of physico?chemical properties and spectral analyses, the structure of the compound was determined as: 2?［2?(3,5?Dimethyl?2?oxo?cyclohexyl)?6?oxo?tetrahydro?pyran?4yl］?acetamide. The herbicidal activity of the compound was assayed by SOP method.

    KEY WORDS  Actinomycete;  Secondary metabolites;  Acetamide;  Herbicidal activity

    利用微生物和生物源产生的活性物质作为新农药的研究开发正受到世界各国研究人员极大的重视［1］。这是因为天然物质一般来说易被界分解而不污染环境，而且还可以利用微生物生长繁殖所需的几乎相同的设备条件和再生资源来生产不同的产品，能耗低、投资省。

    上海市农药研究所在微生物源农药的筛选中发现70014菌株所产生的代谢物质对杂草的生长有显著的抑制作用。为阐明它的杀草活性成分，采用了除草活性跟踪的方法，对其发酵物进行研究，分离纯化得到了1个化合物，利用理化性质和MNR等波谱分析，鉴定出活性组分的结构。本文着重报道SPRI?70014的放线菌所产活性组分的分离提取、结构鉴定及活性研究。

    1  材料与方法

    1.1  试验试剂和仪器

    WRS?1A数字熔点仪(温度计未校正)；Varian INVOA400核磁共振仪；Q?TOF ULTIMA GLOBAL GAA076 LC型质谱仪；LC?AT高效液相色谱仪；Sephadex LH?20和层析用硅胶(G)分别为Pharmacia公司和青岛海洋化工厂产品。活性测试采用国家创制中心室内盆栽试验SOP所制定的生测方法［2］。

    1.2  菌株的分离与培养

    (1)产生菌株  放线菌SPRI?70014从江西新赣地区的土壤中分离得到。

    (2)培养  从28℃培养4d高氏1号培养基上取适量菌体，接种于种子培养基(葡萄糖4.0%，黄豆饼粉3.0%，酵母粉0.5%，硫酸胺0.1%，氯化钠0.1%，磷酸氢二钠0.005%，自来水配制，pH值调至7.2)，于28℃，220r/min的条件下摇床培养2d得到种子培养液。将该种子培养液按10%的接种量接种于400瓶每瓶含50ml液体培养基(成分同上)的250ml三角瓶中，28℃，220r/min摇床培养4d，得发酵液20L。

    1.3  活性测试

    (1)生物活性测试  用上海市农药研究所制定的生测方法［2］进行活性跟踪。

    (2)活性组分的确定  发酵液经过离心分离后，菌丝体用80%丙酮浸泡。酮浸泡液减压浓缩蒸干，得到浸膏，少量甲醇溶解并加水恢复到发酵液原体积；与离心得到的上清液一起，分别稀释20倍，进行活性测定。上清液显示了很强的杀草活性。结果表明活性组分主要集中在上清液中。取30ml上清液，分成三份，分别加入等体积的乙酸乙酯和正丁醇萃取并测试活性。结果表明，只有正丁醇具有与上清液相应的生物活性，故确定活性部位。

    1.4  提取分离

    发酵液高速离心，分为上清液和菌丝体两部分。菌丝体用80%的丙酮液浸泡过夜，滤液经减压蒸馏除去丙酮后，合并上清液共16L，用稀盐酸调节溶液pH值约为5～6，有沉淀析出，静置过夜，过滤得上清液。减压蒸馏浓缩至约5L，等体积的正丁醇萃取三次，提取液浓缩至浸膏状3.8g。先采用层析法［3］，浸膏拌硅胶过柱，以甲醇?氯仿梯度洗脱，收集各馏分，减压浓缩，合并、得到五个色谱部分，每个部分经活性测试，确定其中一个为主要活性部分(A)，再经硅胶板层析、Sephadex LH?20柱色谱和高效制备液相色谱等分离手段，从A中得到化合物三个：A?1(15mg)、A?2(23mg)和A?3(8mg)。经活性测试，确定A?2为主要活性组分。

    2  结果与讨论

    2.1  化合物结构鉴定

    化合物A?2白色粉末MS(EI，)，m/z(%)：219，246，264，282(M+)。1H?NMR(CDCl3)：δ 0.96(d，3H)，1.28(d，3H)，1.42～1.47(m，2H)，1.53～1.62(m，1H)，1.71～1.78(m，1H)，1.89～1.95(m，1H)，2.04～2.10(m，1H)，2.14～2.21(m，1H)，2.32～2.40(m，3H)，2.54～2.59(m，1H)，2.62～2.71(m，2H)，2.74～2.78(m，1H)，4.01～4.06(m，1H)。13C?NMR(CDCl3)，δ14.78(C13)，18.59(C12)，28.39(C8)，28.97(C3)，36.44(C7)，37.89(C4)，39.39(C2)，41.14(C14)，41.68(C10)，44.12(C9)，52.21(C6)，67.55(C5)，175.63(C1)，175.75(C15)，216.34(C11)。

    参照［4］确定结构为2?［2?(3，5二甲基?2?氧?环己基)?6?氧?四氢吡喃?4?基］?乙酰胺(2?［2?(3，5?Dimethyl?2?oxo?cyclohexyl)?6?oxo?tetrahydro?pyran?4yl］?acetamide)(图1)。

    图1    A?2化合物结构

    2.2  除草活性

    采用国家创制中心室内盆栽试验SOP所制定的生测方法，测定了化合物A?2对多种杂草和农作物杀灭活性。A?2化合物主要进行了室内平皿除草活性试验，室内盆栽除草活性试验，室内作物安全性试验等。

    (1)室内平皿除草活性试验发现，在6.25mg/L的剂量下，A?2对6种筛选靶标的生长抑制作用明显，其中对稗草的地上、地下部分的生长抑制率分别为40%和95%；对苋菜地上、地下部分的生长抑制率分别为60%和80%；对其它几种靶标(高粱、马唐、黄瓜，油菜等)地上部分生长抑制作用为30%～40%，地下部分为60%～80%。

    (2)室内盆栽除草活性试验同时进行了茎叶喷雾法和土壤处理，试验靶标为稗草、狗尾、马唐、鳢肠、苋菜和小藜。喷雾法试验发现在62.5mg/L的处理剂量，A?2对苋菜和小藜的鲜重防效分别为100%和88.5%，稗草为37.3%，其余三种靶标(狗尾、马唐和鳢肠)防效都小于25%；500mg/L的剂量时，对阔叶杂草鲜重防效均高于95%，达到100%；对稗草防效为54.8%，对狗尾和马唐的防效低于30%，防除效果不佳。土壤处理发现在500和1000mg/L的剂量下对试验六种靶标的防除作用也都比较明显。在1000mg/L剂量下，对阔叶杂草的鲜重防效高于50%，甚至达到90%，而对单子叶杂草在25%～45%范围。

    (3)作物安全性试验选择六种作物分别是花生(苗龄3叶)、豌豆(4叶)、蚕豆(3叶)、玉米(3叶)、小麦(3叶)和水稻(3叶)。在1000mg/L剂量下，A?2对花生和小麦有很好的安全性。

    3  讨论

    本文采用活性跟踪的方法从一株土壤放线菌SPRI?70014的次级代谢物中分离鉴定了一个具有强杀草活性的A?2化合物。利用紫外、质谱、核磁共振谱等分析方法对A?2化合物的结构进行鉴定，确定主要活性组分结构与日本于1998年发现的骨吸收抑制剂A?75943一致。经检索，该化合物是首次发现选择性除草活性，以申请作为除草剂农药的应用专利。从本次研究的所有试验可以看出，A?2对大部分阔叶杂草的生长抑制作用显著；同时对几种单子叶杂草牛筋草、千金子、香附子防除效果也较好，对稗草和早熟禾防效中等；本次研究试验的同时发现A?2对花生和小麦植株(其它作物还有待进一步试验)都有很好的安全性。所以A?2有望开发成应用于防除作物田多种阔叶杂草和某些单子叶杂草的新型除草剂。

【文献】
  ［1］ 施跃峰. 生物农药及我国的产业［J］. 安徽科技，2001，(8)：17～18.

［2］ Petri dish test for herbicide activity (除草剂培养皿生测法)［A］. SOP for biological evaluation(创制农药生物活性评价)［C］. Shanghai Pesticide Research Institute,2003:456～457.

［3］ Leather G R, Einhelling F A. Bioassay of naturally occurring allelochemicals for phytotoxicity ［J］. J Chem Ecol,14(10):1821～1828.

［4］ Tadaaki Morishita, Aiya Sato, Tomoko Ando, et al. A novel bone resorption inhibitior, A?75943 isolated from Streptomyces sp. sank 61296 ［J］. J Antibiot,1998,51(6):531～538.