夜宁胶囊质量标准研究
作者：丁青龙 李莹 周其 蔡春亚、
【摘要】 目的：研究制定夜宁胶囊的质量标准。方法：采用薄层色谱法和HPLC法。结果：大黄素在5-25μ/ml范围内呈良好线性关系，回归方程为y=39931.1A-22660.4，r=0.9998。每粒首乌藤以大黄素计，不得少于0.05mg。结论：样品的重复性和精密度检查证明本法稳定、可靠、快速、准确，可为本品质量控制方法之一。
【关键词】 夜宁胶囊 大黄素 TLC HPLC；含量测定
夜宁胶囊为2005年版《药典》一部所收载的“夜宁糖浆”的改型制剂；主要由合欢皮、首乌藤、灵芝等药物组成。本方中主药合欢皮、灵芝、首乌藤等均有不同程度的镇静、安神的作用；在制定本品的质量标准时，我们采用薄层色谱分别鉴别合欢皮、灵芝、首乌藤、甘草4味药材，并同时选用大黄素作为本品的含量控制指标，因为在本品中大黄素为臣药首乌藤所独有成分并且检测方法成熟、可靠；故我们最终选择大黄素为本品的含量测定控制指标。
1 仪器及试剂
1.1 仪器 日本岛津公司LC?10ATvp型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，RE?52C型旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂)，FQC?100超声波清洗机(无锡福尼达公司 频率为40KHZ)，SC202?1型电热恒温干燥箱(通州市沪通制药机械设备厂)，FA1004型十万分之一电子天平(上海精密仪器有限公司)，电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)
1.2 试样 夜宁胶囊(江苏康缘药业股份有限公司，批号：030410、030510、030526)，合欢皮对照药材(中国药品生物制品检定所提供编号121549—200501)，灵芝对照药材(中国药品生物制品检定所提供，编号120968—200505)，甘草次酸对照品(中国药品生物制品检定所提供，编号110723—200411)，大黄素对照品(中国生物制品研究所 批号0756—200110供含量测定用)，乙醇(分析纯)，氯仿(分析纯)，浓盐酸，蒸馏水，甲醇(色谱纯)，0.1%磷酸，重蒸蒸馏水(高纯度蒸馏水)。
2 薄层鉴别［1-4］
2.1 合欢皮 取本品内容物2g，加甲醇30ml溶解，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取合欢皮对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录Ⅵ B )试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点样于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—甲醇—甲酸(6∶0.5∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的斑点［5-6］。
2.2 灵芝 取本品内容物2g，加水20ml溶解，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取灵芝对照药材1g，加乙醇10ml浸泡24h，滤过，滤液作为对照药材溶液。照薄层色谱法( 中国药典2005年版一部附录Ⅵ B )试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(4∶1)的为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下视检。供试品色谱中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点［7,1］。
2.3 甘草 取本品内容物2g，置100ml圆底烧瓶中，加入50ml氯仿，3ml浓盐酸，置水浴上加热回流1h，放冷，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取甘草次酸对照品，加氯仿制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G254薄层板上，以石油醚(30-60℃)—甲酸乙酯—甲酸(13∶7∶1)的上层溶液为展开剂，展开，展距15cm，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下视检。供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2.4 首乌藤 取本品内容物2g，加石油醚50ml回流提取1h，滤过、挥去石油醚，残渣用甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。另取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法( 中国药典2005年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30-60℃)—甲酸乙酯—甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下视检。供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结果：同法制备阴性样品，阴性无干扰；证明薄层色谱法具有很好的专属性。
3 含量测定
3.1 色谱条件［8］ 色谱柱C18柱；流动相：甲醇—0.1%磷酸溶液(82：18)，流速1ml／min-1；检测波长254nm，柱温40℃。理论板数为1000以上，进样体积为10μl。
3.2 供试液样品的制备 取本品5粒，将内容物倒入锥型瓶中并用乙醚洗净，挥去乙醚；分别加95%乙醇40、40、40、40ml超声提取30、20、20、10min，抽滤，合并滤液于旋转蒸发仪上回收乙醇。残渣用水洗4次(20、20、10、10ml)。合并洗液用盐酸调pH为2-3于水浴锅上水解1h(80℃)后于分液漏斗中用氯仿萃取4次(20、20、10、10ml)。充分振荡，最后一次萃取液应呈无色。合并氯仿液于旋转蒸发仪上回收氯仿。残渣用甲醇溶解并定容至10ml。用0.45μm的微孔滤膜滤过，备用。［8］
3.3 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品4mg用甲醇超声溶解制成2ml／min-1的对照品溶液，备用。
3.4 标准曲线的制定 精密吸取对照品液5、10、15 、20、 25μl分别置于2ml的量瓶中，用甲醇定容、摇匀。以对照品进样量浓度为纵坐标，峰面积值为横坐标绘制标准曲线。结果大黄素在5～25μg/ml范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=39931.1A-22660.4；r=0.9998［5］。
3.5 精密度试验 对同一对照品溶液，连续测定5次，结果其峰面积值的RSD为0.16%。
3.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在制备后的0、2、4、6、8、10h进样，测定大黄素峰面积，得RSD为2.38%，表明供试品溶液在10h内稳定。
3.7 重复性试验 对同一批号样品，分别取6份，按供试品液的提取方法提取，依法测定，结果夜宁胶囊中大黄素的含量平均值为0.0521mg/粒；RSD=2.11%。
3.8 样品含量测定 按3.2项制备供试液，依法进性测定，结果见表1。
表1 样品含量测定结果（略）
3.9 加样回收率测定 精密量取已知含量(1mg/ml)的对照品溶液10μl加入到样品中按3.2项下方法提取制备供试品液，依法测定［9-10］，结果见表2。
表2 加样回收率试验（略）
结论：本品每粒含首乌藤以大黄素(C15H10O5)计，不得少于0.05mg。
4 讨论
4.1 试验提取条件的选择：(1)本研究在进行提取时将传统回流提取法、索氏回流提取法、超声提取法进行了简单的比较，结果发现超声提取较为方便、简单；(2)关于水解条件的选择：本研究结合报道以不同的pH值、不同的水解温度及不同的水解时间进行了正交筛选，得出在pH为2-3、温度80℃、水解1h为本实验的最佳水解条件;(3)对提取后的残渣再进行不同处理：分别为水溶解、酸水解、用氯仿萃取后、回收氯仿用甲醇定容，依法测定［9-10］。
4.2 流动相的pH值对实验有较大的影响，因为蒽醌类化合物呈弱酸性，在酸性条件下色谱行为得到明显改善，采用0.1%的磷酸代替水取得了较好的分离效果。本方法测定样品中大黄素，方法灵敏、可靠，可作为本品的含量测定方法。［9］
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