蜂胶左金胃三联抗幽门螺杆菌体外抑菌实验研究
作者：李平 周华 楚更五 张军会 刘红茹 杨艳
【摘要】 目的：为了的证实蜂胶左金胃三联抗幽门螺杆菌(HP)的有效性。方法：采用正交试验设计，优选HP固体培养处方，琼脂倍比稀释法测定3种药物抑制HP的MIC；同时进行联合药敏实验以测定各药及分别组合后抑菌环大小比较、MIC测定；结果：黄连与吴茱萸联合应用对HP呈相加作用；黄连与蜂胶联合应用对HP呈协同作用；3联药联合应用对HP呈协同作用，表明蜂胶、黄连、吴茱萸3种药物联合应用后体外抗HP作用显著增强，且有量效依赖关系。结论：蜂胶左金胃三联抗HP体外抑菌有效。
【关键词】 蜂胶左金胃三联；HP；体外抑菌；实验研究
1 材料与方法
1.1 材料 蜂胶：由云南丁氏蜂业工贸公司鉴定出售；川黄连、吴茱萸由昆明鸿祥药业鉴定出售；HP标准菌株由疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。
1.2 方法［1］ 蜂胶浸膏的制备工艺:称取蜂胶1.8kg，按重量比加5倍的70%乙醇9L，浸泡24h，倒出滤液；滤渣加80%乙醇3L，浸泡24h过滤；滤渣再次重复浸泡过滤(方法同第2次)，合并3次滤液，回收乙醇，得浸膏0.9kg，即1kg浸膏相当于2kg生药材。40℃冰储备用。黄连、吴茱萸及全方药液浸膏的制备工艺(略)。
2 实验药液制备
将制备好的黄连、吴茱萸和蜂胶浸膏按6：1：0.5比例混合成全方浸膏，1kg浸膏相当于3.75kg生药材。40℃冰储备用。
2.1 材料 蜂胶浸膏：1kg浸膏相当于2kg生药材;黄连浸膏：1kg浸膏相当于3.35kg生药材;吴茱萸浸膏：1kg浸膏相当于3.75kg生药材;全方浸膏：1kg浸膏相当于3.75kg生药材;溶解剂：二甲基亚砜由国药集团化学试剂有限公司出品。
2.2 方法 预实验结果示二甲基亚砜对4种浸膏有较好的溶解性，且无抑制HP作用。各药物浸膏的药液配制如下：蜂胶药液的制备：用分析天平准确称取蜂胶浸膏1g，按每次1ml逐量加入二甲基亚砜至25ml溶解完全，得蜂胶药液浓度为80mg/ml，40℃冰储备用。黄连、吴茱萸及全方药液的制备(略)。
3 药物对HP的体外抑菌实验
3.1 材料 实验药物：蜂胶浸膏药液80mg/ml；黄连浸膏药液258mg/ml；吴茱萸浸膏药液125mg/ml；全方浸膏药液125mg/ml；阿莫西林钠(益萨林):0.5g/支(哈药集团制药总厂生产,用2ml蒸馏水稀释得阿莫西林药液浓度为0.25g/ml)。实验菌株:HP标准菌株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。培养基:固体培养基的配制方法：哥伦比亚琼脂中添加5.3%浓度小牛血清和2.6%浓度混合抗生素，调pH值为7.5。比浊管：卫生部药品生物制品检定所出品。六孔瓷盘反应板：唐山陶瓷股份有限公司出品。八面扇形灭菌纸片:自制。微量加样器：美国Eppendorf公司出品。电热恒温水浴箱：天津市泰斯特仪器有限公司出品，HH.W21.420型。
3.2 方法
3.2.1 各药液的倍比稀释 蜂胶、黄连、吴茱萸、全方浸膏原液的浓度分别为80、258、125、125mg/ml。分别取灭菌试管8支,将每味中药原液1ml，用二甲基亚砜倍比稀释为以下处理浓度：蜂胶分别为1：1浓度(即80mg/ml)，1：2浓度(即40mg/ml)，1:4浓度(即20mg/ml)，1：8浓度(即10mg/ml)，1：16浓度(即5mg/ml)，1：32浓度(即2.5mg/ml)，1：64浓度(即1.25mg/ml)，1：128浓度(即0.625mg/ml)。黄连、吴茱萸、全方分别按上述倍比稀释方法类推。含药纸片、固体培养基、HP菌悬液的制备(略)。
3.2.2 K?B法抗菌实验测定抑菌环 将配制好的固体培养基浇入各培养皿中，37℃恒温箱培养3d后取出，用直尺测量抑菌环直径，用抑菌环直径的大小反映药物抑菌作用的强弱。双份试验，取其平均值。
3.2.3 琼脂倍比稀释法测各药物抑制HP的MIC 将倍比稀释的不同浓度各药液与配制好的哥伦比亚琼脂固体培养基按不同比例配制成1ml含各浓度药物琼脂，充分混匀，待完全凝固后，用微量加样器接种以上配制好的HP菌液1μl于每个瓷孔的药物琼脂表面，均匀涂布，于37℃微需氧培养3d，观察以HP生长被完全抑制的最低药物浓度值为该药对HP的MIC。
3.2.4 联合药敏试验［2］ (1)黄连与吴茱萸对HP的联合药敏试验结果(方法略)见表1。(2)黄连与蜂胶对HP的联合药敏试验(略)。(3)蜂胶与吴茱萸对HP的联合药敏试验(略)。
表1 黄连与吴茱萸对HP的联合药敏试验结果（略）
注：?无细菌生长，+有细菌生长；FIC指数≤0.5为协同作用，>0.5-1为相加作用，＞1-2为无关作用，＞2为拮抗作用。
4 结果
4.1 抑菌环的测定结果 见表2。
表2 各药物不同浓度HP的抑菌环直径（略）
注：抑菌环直径为双份纸片实验的平均值。
由表2表明，以HPSS1标准菌株为实验菌株，测定各药物不同浓度的抑菌环直径大小，结果：全方抑菌环大于3味单药，其中蜂胶抑菌环大于吴茱萸,随各药物浓度递减，抑菌环逐渐缩小，黄连最大抑菌环达40mm。
4.2 MIC的测定结果［3］ 见表3。
表3 各药物抗HP的MIC（略）
注：+细菌生长，?细菌未生长。
表3表明，全方、黄连、蜂胶、吴茱萸抗HP的MIC分别为7.813 mg/ml, 8.063 mg/ml，10mg/ml，15.625mg/ml。阿莫西林经10倍稀释后测得MIC为0.25μg/ml。
4.3 3种药物的联合药敏试验结果 FIC指数=1.613／3.225+0.195／6.25=0.53——相加作用。
5 讨论
5.1 本实验以HPSS1标准菌株为实验菌株测定的各种药物,均能形成大小不等的抑菌环，且边界清晰；全方及蜂胶、黄连和吴茱萸3味单药对HP均有较强抑菌作用；全方抑菌作用大于3味单药，其中蜂胶抑菌环大于吴茱萸，表明蜂胶抗HP作用强于吴茱萸；随各药物浓度递减，抑菌作用逐渐减弱；黄连最大抑菌环达40mm。
5.2 全方、黄连、蜂胶、吴茱萸抗HP的MIC分别为7.813mg/ml，8.063mg/ml，10mg/ml和15.625mg/ml。全方抗HP的MIC最低，黄连、蜂胶、吴茱萸MIC依次增大。表明抑菌环和MIC的走势一致,二者均能表示实验药物的抗菌强弱。
5.3 试验表明：黄连与吴茱萸联合应用对HP呈相加作用；黄连与蜂胶联合应用对HP呈协同作用；3药组合应用对HP呈协同作用，表明蜂胶左金胃三联抗HP体外抑菌有效,且有量效依赖关系。
【】
［1］韩宪忠,聂 进,付晓泰,等.正交试验法优选延胡索黄连复方的提取工艺［J］.中成药,2004,26(8):675-676.
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