L5前根切断大鼠模型中背根神经节P2X3受体表达

【摘要】  目的：探讨L5前根切断（L5 VRT）大鼠神经病理性疼痛模型背根神经节（DRG）P2X3受体表达。方法：雄性SD大鼠30只，随机分为5组（n=6），A组（L5 VRT术后3 d）、B组（L5 VRT术后7 d）、C组（L5 VRT术后14 d）、D组（L5 VRT术后21 d）模型组和E组（假手术组），E组仅行半椎板切除术暴露左侧脊髓，分别在各自的时间点灌注取材L5背根神经节，用免疫荧光染色方法观察P2X3受体表达的变化。结果：（1）L5前根切断手术后，大鼠从次日开始即能产生双足明显的机械痛敏，与E组相比差异有统计学意义（P<0.05），这种痛敏情况持续至少4周；（2）免疫荧光染色发现B组、C组及D组模型组同侧L5 DRG的P2X3 受体的表达明显增加（P<0.01），B组、C组及D组模型组对侧L5 DRG的P2X3 受体的表达与E组相比变化不明显（P>0.05）；A组模型组的双侧L5 DRG的P2X3 受体的表达与E组相比无明显变化（P>0.05）。结论：（1）L5前根切断疼痛模型能产生双足明显的机械痛敏；（2）该模型背根神经节P2X3受体的表达变化可能参与其机械痛敏的机制。

【关键词】  P2X3受体；神经病理性疼痛；L5前根切断；背根神经节
   
　　［Abstract］Objective: To observe the P2X3 receptor expression in lumbar 5 dorsal root ganglion（L5 DRG）with lumbar 5 ventral root transection (L5 VRT). Methods: Thirty male Sprague?Dawley rats were randomly divided into 5 groups, group A 3 days after L5 VRT, group B 7 days, group C 14 days, group D 21 days and group E of  sham operation, whose left spine cords were exposed by hemilaminectomy. Rats in each group were respectively perfused with paraformaldehyde and materials were taken from L5 dosal root ganglions and the changes of expression of P2X3 receptor were observed with immunofluorescence staining. Results: (1) Compared with the control group, rats after operation could generate bilateral mechanical allodynia which could persist for at least 4 weeks (P<0.05); (2) The expressions of the receptors of P2X3 in ipsilateral L5 DRG of 7 days, 14 days and 21 days after transection were significantly increased compared with the control group (P<0.01), but in contralateral L5 DRG of 7 days, 14 days and 21 days were not changed and neither in bilateral L5 DRG in group A (P>0.05). Conclusions: (1) The rats with L5 VRT can generate bilateral mechanical allodynia; (2) The changes of expression of P2X3 receptor in DRG of rats with L5 VRT might play a role in the mechanism of mechanical allodynia.
 
　　［Key words］P2X3 receptor; Neuropathic pain; Lumbar 5 ventral root transection; Dorsal root ganglion
   
　　神经病理性疼痛是由于外周或中枢神经系统的直接损伤或功能紊乱所致，在损伤修复后疼痛仍可能长期存在，它以自发性疼痛、痛觉过敏、异常性疼痛为特征，其机制复杂，目前认为与外周和中枢敏化相关［1?3］。背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）作为痛觉传入的第一级神经元，在痛觉的外周机制中起着极为重要的作用。近年来研究表明，DRG神经元在炎性痛和神经源性痛的情况下可发生显著的可塑性变化，如神经肽、受体、酶和细胞表面分子的表达都发生了不同水平的上下调变化。P2X3受体属于嘌呤受体（purinergic receptors），它选择性地表达在DRG神经元中与疼痛感觉相关的中、小神经元［4］。L5前根切断模型（L5 VRT）是一种较新的疼痛模型，该模型在椎管内切断L5的前根，而不影响感觉神经，但是会出现很明显的机械痛敏和短暂的热痛敏，并且会出现明显的镜像痛［5］。本文通过观察该模型中背根神经节P2X3受体表达的变化，探讨其机械痛敏的产生机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料及器材

    手术器械（无菌手术刀、有齿镊、咬骨钳、线剪、眼科剪、三棱针、玻璃分针等）；Von Frey Filament（stoelting，USA）及相关设备；动物灌注装置（自制）；冰冻切片机（leica CM3050，德国）；荧光显微镜 （leica DFC 350FX，德国）；10%水合氯醛（购自中山大学第一附属）；兔抗 P2X3 受体血清（neuromics， Minneapolis，MN，USA)；羊抗兔的IgG?cy3（chemicon）；正常羊血清（北京中山金桥）；牛血清白蛋白（北京中山金桥）；多聚甲醛（sigma，USA）；TritonX?100（sigma，USA）。

　　1.2 动物及分组
      
　　选用Sprague?Dawley（SD）雄性大鼠，体重180～220 g，由广州中山大学实验动物中心提供。实验随机分为5组（n=6），L5 VRT术后3 d（A组）、7 d（B组）、14 d（C组）、21 d（D组）模型组和假手术组（E组），E组仅行半椎板切除术暴露左侧脊髓。

　　1.3 L5 VRT模型的制作

    用10%水合氯醛麻醉（3.5 mL/kg，i.p.）大鼠，按照Li 等［5］描述的方法对大鼠行L5 前根切断手术。先在L4 至L5间进行半椎板切除术，暴露脊髓后，用三棱针轻轻划破外侧脊膜，然后用一特制的玻璃分针轻轻从背根下方提起前根，用虹膜剪剪去2～3 mm 的前根，分层缝合。假手术组仅行半椎板切除术，暴露脊髓，不行前根切断。

　　1.4 行为学测试

    用Von Frey纤维丝测定大鼠的机械刺激撤足阈值（paw withdrawal threshold，PWT）。测试时将大鼠放置于测试的有机玻璃箱中，采用Chaplan等［6］报道的Up?Down方法，检测大鼠50%的机械刺激撤足阈值。选8根强度呈对数递增方式的Von Frey Filament（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14 g）分别对大鼠后肢左右脚足心部进行机械性刺激，每次刺激持续时间为6～8 s。首先用力度为2.04 的Von Frey Filament 开始测试，测试时Von Frey Filament 垂直，微弯，在大鼠足心部保持6～8 s，出现快速撤足为阳性反应，若撤足反应为阴性则选用刺激强度呈对数递增的相邻von Frey filament 继续刺激，若撤足反应为阳性，则选择相邻递减的刺激强度给予刺激。如此反复，以第一个转折点的前一点为起点，连续6次的刺激结果为最终的撤足反应模式（撤足反应呈持续阳性则为5 次刺激，撤足反应呈持续阴性则为4次刺激，刺激次数最多为9 次）。

　　1.5 动物灌注及标本处理

    大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL/kg麻醉，开胸暴露心脏，灌注用针经左心室置入主动脉灌注生理盐水至流出液不含红色，然后灌注含4%多聚甲醛约400 mL，固定30 min，取大鼠同侧及对侧L5 DRG后，放入4%的多聚甲醛中固定3 h，再转入4 ℃ 30%蔗糖溶液经24～48 h至组织沉底。用恒冷冰冻切片机（Leica CM3050,德国）切片，DRG切片厚度为16 μm，置于含有0.01 M PBS 的24 孔板内，4 ℃短暂保存。

　　1.6 免疫荧光染色

    DRG冰冻切片用0.01 M PBS液洗3 次，每次 5 min，然后在室温下加封闭液，1 h 后吸去封闭液并加入兔抗大鼠P2X3抗体（1∶1 000；Neuromics，USA），置在 4 ℃ 冰箱24～48 h，吸去一抗，用0.01 M PBS 液洗3 次，加入标记Cy3 的羊抗兔二抗（1∶200，chemicon，USA），避光室温下作用1 h，再用0.01 M PBS液洗3 次，随机挑选切片贴于载玻片上，立即于荧光显微镜（德国Leica DFC 350FX）下观察并拍照。

　　1.7 数据分析及统计学处理

    行为学测试结果均采用非参数检验进行分析。同一组大鼠不同测试时间点的数据用配对的秩和检验（Wilcoxon matched pairs test）；两个不同实验组某个测试日间的数据比较采用u 检验（Mann?Whitney u test）。
        
　　免疫荧光染色结果处理方法：每只大鼠随机（用随机数表法）挑取双侧L5 DRG切片各6张，在荧光显微镜下计数每张切片上的P2X3 阳性细胞百分比，并由此算出每只大鼠P2X3阳性细胞百分比的均数，每个实验组共计数6 只大鼠，最后出每组P2X3阳性细胞百分比的均数±标准误（Mean±SEM）。先用单因素方差分析处理数据，然后用Tukey post hoc test检测组间差异。统计学分析通过SPSS进行，所有数据用均数±标准误（Mean±SEM）表示，P<0.05 认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 一般行为学及足部形态的观察

    在L5前根切断手术后的观察时间内，所有大鼠均保持良好的健康状态。体重增加正常，没有明显的伤口感染征象，总体活动状态与正常大鼠没有明显的差别。但L5前根切断侧的足趾并拢，足呈轻度的外翻状。见图1A、图1B。

　　2.2 L5 VRT模型组与假手术组大鼠机械痛敏比较

    Von Frey纤维测定手术侧及对侧后肢50%撤足阈值。手术前动物对这种轻微的机械性刺激反应微弱，大部分的动物对最粗的Von Frey纤维（15.14 g）的刺激毫无反应，而术后几乎所有的动物对实验中所用的2.04 g的机械刺激撤足反应均为阳性，部分痛敏明显的动物对0.41 g的机械刺激都有明显的撤足阳性反应。

    从图2可发现，L5 VRT术后不同时间机械痛敏明显，与假手术组相比差异有统计学意义（P<0.05），且L5 VRT的双足机械痛敏情况持续至少1月余。

　　2.3 L5 VRT模型大鼠同侧L5 DRG的P2X3受体的表达变化

    A 组的双侧L5 DRG的P2X3表达与E组相比无明显变化（P>0.05）。B组及C组、D组的对侧L5 DRG的P2X3受体的表达与E组相比无明显变化（P>0.05），但同侧L5 DRG的P2X3受体的表达与E组相比明显增加，差异具有统计学意义（P<0.001）。见表1、图3、图4。表1  假手术组与术后不同时间点同侧L5背根神经节P2X3阳性细胞百分比（略）

　　3 讨论

    本实验通过建立L5 VRT大鼠疼痛模型，应用免疫荧光技术观察了该模型中不同时间点的P2X3受体在大鼠的DRG上的表达，P2X3受体主要表达在DRG的小神经元和中等神经元上，与报道［4］一致。

    在疼痛的基础研究中，既往很多外周神经损伤的模型，如CCI（chronic constriction injury）、SNI（spared nerve injury）、SNL（spinal nerve ligation）、PLSN （partial ligation of the sciatic nerve）等都是损伤轴突或初级感觉神经元，从而模拟损伤区异位放电而研究疼痛的机制［7］。近年来很多研究表明，邻近未受损的神经元也参与了疼痛的发生和维持［8］。在本实验研究中，我们采用的是一种比较新的疼痛模型，即L5前根切断的模型，其主要特点是不损伤感觉纤维的初级感觉神经元及轴突，术后次日行为学测试发现双足明显的机械痛敏，这种痛敏状态可持续至少4周，与Xu等［9］的研究一致，这可能是因为切断前根后局部的神经纤维脱髓鞘，感觉神经元完全暴露在华勒变性的环境中，从而通过细胞因子、炎性介质等作用于初级感觉神经元，引起初级感觉神经元异位放电同时伴有胶质细胞激活，而产生明显的病理性疼痛。
   
　　外周神经损伤可以调节P2X3受体的表达，其变化程度取决于损伤的类型。被ATP活化的P2X3受体在伤害性神经元上有表达，在CCI模型中P2X3受体在DRG小神经元中的表达是增加的［10］。Tsuzuki等［11］用原位杂交的方法发现神经损伤后在未受损的神经元中的P2X3 mRNA表达增加，但神经纤维被切断的神经元P2X3 mRNA表达下降。在L5 SNL（the L5 spinal nerve ligation）术后3 d直至整个实验观察期间未发现L4 DRG P2X3 mRNA 表达的改变［12］。这意味着在不同的神经病理性疼痛模型中，未受损的神经元中存在着不同的表型变化和病理机制。在我们的实验中发现不同时间点同侧L5 DRG中P2X3受体的表达增加，主要考虑L5 DRG受到邻近的神经损伤引起华勒变性的影响。Fukuoka等［12］认为，直接损伤的神经元其周围的胶质细胞激活，神经元释放的神经递质和胶质细胞释放的细胞因子等的协同作用，可能对这种邻近未受损的神经元中的P2X3受体表达的增加起了相当的作用。

    实验中我们发现行L5前根切断后，能产生明显的双足机械痛敏，即镜像痛。有研究指出镜像痛的产生可能与脊髓背角中间神经元的交互作用、胶质细胞激活及细胞因子（TNF?α、IL?1β及IL?6等）的参与有关［9,13,14］。而在我们的实验中观察到手术对侧P2X3 受体的表达无明显改变，说明在该模型中手术对侧的机械痛敏的改变与该侧P2X3 受体的表达无明显相关性，具体的机制仍有待进一步研究。
   
　　总之，我们的实验通过建立L5前根切断的大鼠疼痛模型，产生双足的机械痛敏，在此基础上，应用免疫荧光染色的方法观察了L5 DRG中P2X3 受体的表达特点，其同侧L5 DRG中P2X3 受体表达的时间性可能参与了该模型痛敏发生的机制。预先给予选择性的P2X3受体拮抗剂A?317491，再观察L5 VRT大鼠的机械痛敏，进一步明确在该模型中P2X3 受体的影响作用，这将是我们进一步研究的问题。
  
　　致谢：本实验大部分工作在中山大学疼痛研究中心完成，得到各位老师及同学的帮助，特此表示感谢。

【文献】
  　［1］Zimmermann M. Pathobiology of neuropathic pain ［J］. Eur J Pharmacol, 2001, 429(1?3): 23?37.

　　［2］Woolf CJ, Mannion RJ. Neuropathic pain: aetiology, symptoms, mechanic?sms, and management ［J］. Lancet, 1999, 353(9168): 1959?1964.

　　［3］Woolf CJ, Salter MW. Neuronal plasticity: Increasing the gain in pain ［J］. Science, 2000, 288(5472): 1765?1769.

　　［4］Burnstock G. P2X receptors in sensory neurons ［J］. Br J Anaesth, 2000, 84(4): 476?488.

　　［5］Li L, Xian CJ, Zhong JH, et al. Effect of lumbar 5 ventral root transection on pain behaviors a novel rat model for neuropathic pain without axotomy of primary sensory neurons ［J］. Exp Neurol, 2002, 175(1): 23?34.

　　［6］Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw ［J］. J Neurosci Methods, 1994, 53(1): 55?63.

　　［7］Decosterd I, Woolf CJ. Spared nerve injury: an nimal model of persistent peripheral neuropathic pain ［J］. Pain, 2000, 87(2): 149?158.

　　［8］Wu G, Ringkamp M, Hartke TV, et al. Early onset of spontaneous activity in uninjured C?fiber nociceptors after injury to neighboring nerve fibers ［J］. J Neurosci, 2001, 21(8): 1?5.

　　［9］Xu JT, Xin WJ, Wei XH, et al. p38 activation in uninjured primary afferent neurons and in spinal microglia contributes to the development of neuropathic pain induced by selective motor fiber injury ［J］. Experimental neurology, 2007, 204: 355?365.

　　［10］Novakovic SD, Kassotakis LC, Oglesby IB, et al. Immunocytochemical localization of P2X3 purinoceptors in sensory neurons in naive rats and following neuropathic injury ［J］. Pain, 1999, 80(1?2): 273?282.

　　［11］Suzuki K, Kondoa E, Fukuoka T, et al. Differential regulation of P2X3 mRNA expression by peripheral nerve injury in intact and injured neurons in the rat sensory ganglia ［J］. Pain, 2001, 91(3): 351?360.

　　［12］Fukuoka T, Tokunaga A, Tachibana T, et al. VR1, but not P2X3, increases in the spared L4 DRG in rats with L5 spinal nerve ligation ［J］. Pain, 2002, 99(1?2): 111?120.

　　［13］Koltzenburg M, Wall PD, McMahon SB. Does the right side know what the left is doing ［J］? Trends Neurosci, 1999, 22(3): 122?127.

　　［14］Milligan ED, Twining C, Chacur M, et al. Spinal glia and proinflammatory cytokines mediate mirror?image neuropathic pain in rats ［J］. J Neurosci, 2003, 23(3): 1026?1040.