HPLC法测定甲磺酸培氟沙星片含量及有关物质

                       作者：李绪伦，李霞，曾杰，刘映倩 

【摘要】  目的：建立高效液相色谱法测定甲磺酸培氟沙星片中药物及有关物质。方法：色谱柱为C18柱（150 mm×6 mm，5 μm），流动相为乙腈?2.70 g/L十六烷基三甲基溴化氨与6.18 g/L硼酸溶液的混合溶液（用1 mol/L氢氧化钠溶液准确调pH至8.30）?硫二甘醇（30∶70∶0.2），检测波长为273 nm。结果：甲磺酸培氟沙星在 17.18～85.90 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系（r= 0.999 9），其平均回收率为99.50%、99.71%、99.62%，最低检测限和定量限分别为 0.01989 ng和0.08517 ng，与杂质及喹诺酮类同系物能有效分离。结论：本方法操作简便、结果准确、专属性强，可用于甲磺酸培氟沙星片中药物含量及有关物质的检测。

【关键词】  甲磺酸培氟沙星；高效液相色谱法；有关物质
   
　　［Abstract］Objective:To establish a method for the assay of pefloxacin mesilate tablets and its related substance by HPLC. Methods: The analysis was conducted by HPLC using a C18 (150 mm×6 mm, 5 μm) column. The mobile phase was acetonitrile?mixture of 2.70 g/L cetyltrimethylammonium bromide with 6.18 g/L boric acid solution (adjusted to pH 8.30 with 1 mol/L sodium hydroxide)?2,2′?thiodiglycol (30∶70∶0.2).  The detection wavelength was set at 273 nm. Results: The precision and stability were fine. The linear correlation of pefloxacin mesilate tablets was observed within the range of 17.18～85.90 μg/mL (r=0.9999). The average recoveries were 99.50%, 99.71% and 99.62%. The limit of detection and quantification was 0.01989 ng and 0.08517 ng respectively. The resolution between the respective peaks of pefloxacin mesilate with the other peaks conformed to the requirements. Conclusions: The method is simple, accurate and specific, and reproducible for the assay of pefloxacin mesilate tablets and its related substance.

　　［Key words］Pefloxacin mesilate; High performance liquid chromatograph; Related substance
   
　　甲磺酸培氟沙星是第三代喹诺酮类抗菌药物，主要作用于细菌细胞的DNA回旋酶，干扰细菌DNA的合成，使细菌死亡。对泌尿生殖系统感染、胃肠道感染、伤寒、皮肤软组织感染具有很好的效果。《药典》2005年版二部收载该品种，采用HPLC法进行有关物质及含量控制［1］。但我们在进行方法学考察时发现，其色谱系统不能将其与其前体原料药诺氟沙星有效分离，故本文参照EP6.2（欧洲药典6.2版）［2］重新建立了甲磺酸培氟沙星及有关物质含量的HPLC分析方法。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器

    Agilent1100高效液相色谱仪（四元泵，自动进样器，紫外检测器和DAD检测器）。

　　1.2 试药与试剂

    甲磺酸培氟沙星片（规格：0.2 g，批号：070503、070701、070702，宜昌人福药业有限责任公司提供；规格：0.2 g，批号：070901、070902、070903，山西太原药业有限公司提供；规格：0.2 g，批号：070801、070802、070803，湖北科益药业股份有限公司提供；规格：0.1 g，批号：071102，规格：0.2 g，批号：071101、080102，内蒙古通辽制药有限公司提供）；甲磺酸培氟沙星对照品（批号：130459?200301，含培氟沙星71.1%，由中国药品生物制品检定所提供）；乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯，纯化水自制；硫二甘醇为进口试剂，Alfa Aesar产品。

　　2 色谱条件

    色谱柱：Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.60 mm，5 μm，适宜范围：pH 1～12）；Phenomenex Luna C18（250 mm×4.60 mm，5 μm，适宜范围：pH 1.5～10.0），SHISEIDO MG C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，适宜范围：pH 2～10）；流动相：乙腈?2.70 g/L十六烷基三甲基溴化氨与6.18 g/L硼酸溶液的混合溶液（用1 mol/L氢氧化钠溶液准确调pH至8.30）?硫二甘醇（30∶70∶0.2）；检测波长273 nm；流速：1.0 ml/L；柱温为30 ℃；进样量：20 μL。

　　3 方法学考察

　　3.1  专属性试验

　　3.1.1  强降解破坏试验 

　　取本品适量，加流动相溶解成4 mg/mL的溶液，量取10 mL共3份，置25 mL量瓶中，分别加1 mol/L盐酸溶液5 mL、1 mol/L 氢氧化钠溶液1 mL、10％过氧化氢溶液0.2 mL，室温放置4 h后，分别加酸或碱中和，加流动相稀释至刻度，滤过，作为上述破坏的供试品溶液。另取本品适量，加流动相溶解成4 mg/mL的溶液，量取10 mL共3份，分别置80 ℃水浴放置4 h、4 000 lx光照48 h、紫外光照射24 h，加流动相稀释至25 mL，取上述6种溶液各20 μL进样测定，记录色谱图。结果显示供试品溶液对酸、碱、热均较稳定，对氧和光稳定性较差，特别是紫外光照射对其稳定性影响较大。各种破坏产物除酸破坏在主峰后产生一杂质峰外，其余破坏产物均在主峰之前出峰。所产生的杂质峰均与主峰有良好的分离度，表明本方法有良好的专属性。结果见图1。

　　3.1.2  喹诺酮类同系物的分离试验 

　　以诺氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、司帕沙星、氟罗沙星、洛美沙星、吡哌酸、加替沙星为对照，考察这些物质与培氟沙星峰的分离情况。结果培氟沙星与上述同系物均能有效分离，详见图2。

　　3.1.3  峰纯度检查 

　　将各破坏的样品溶液用二极管阵列检测器进行了纯度检测，结果其主峰纯度均大于990，符合要求。

　　3.2 线性实验

    取培氟沙星对照品溶液，按前面确定的色谱条件进样，以峰面积A对浓度C进行回归，求得的回归方程为A＝62117.7C-8.0480，r＝0.9999，培氟沙星在17.18～85.90 μg/mL范围内呈良好线性关系。

　　3.3  精密度试验 

    取培氟沙星对照品适量，加水溶解并定量稀释成每毫升含培氟沙星20 μg的溶液，按前面确定的色谱条件测定峰面积，连续进样6次，结果RSD=0.15%，表明此方法精密度良好。

　　3.4 回收率试验 

    取三个处方差异较大的生产厂家的样品（宜昌人福、湖北科益、山西太原），采用对照品加样品进行回收率试验。分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（分别相当于测定浓度的80%、100%和120%），测定其含量，将实测值与理论值比较，回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。结果3个生产厂家3种处方工艺的样品平均回收率分别为99.50%、99.71%、99.62%，RSD分别为0.80%、0.99%、0.41%，结果显示方法准确可行。

　　3.5 溶液的稳定性考察 

    本品在水中和流动相中均溶解良好，故对样品在两种溶液中的稳定性均进行了考察，分别采用水和流动相溶解样品，室温放置0、2、4、6、8、10 h后取样，照上述色谱条件进行峰面积测定，计算RSD。结果在水溶液和流动相中RSD分别为0.23%和0.30%，柱效分别为9 476和10 632。表明本品在水溶液和流动相溶液中室温放置10 h均稳定。

　　3.6 检测限及定量限 

    取培氟沙星对照品溶液进行稀释，按上述确定的色谱条件进样，测得培氟沙星检测限为0.01989 ng（以信噪比为3计），定量限为0.08517 ng（以信噪比为10计）。

　　4 有关物质及含量测定

    分别配制4个厂家各3个批号的供试品溶液，按前述色谱条件进行有关物质及含量检测，结果杂质峰出峰时间均在主峰前，杂质及培氟沙星的含量结果见表1。表1  有关物质及含量测定结果（略）

　　5 讨论

    甲磺酸培氟沙星合成工艺一般由诺氟沙星与甲醛、甲酸进行甲基化反应生成甲基物（培氟沙星），再与甲磺酸在乙醇溶液中进行成盐反应生成甲磺酸培氟沙星，因此甲磺酸培氟沙星中主要的杂质为其原料诺氟沙星。如果用《药典》2005版［1］流动相系统，水相的pH值为2.5，诺氟沙星与培氟沙星峰在同一位置出峰，不能分离，而采用本文试验条件所述流动相系统，水相pH值为8.3，诺氟沙星峰与培氟沙星峰能有效分离（分离度15.32）。以培氟沙星为主峰，诺氟沙星相对出峰时间为0.4，在此相对保留时间处，强破坏试验中检出相应杂质峰。

　　采用实验条件所述流动相系统，其有机相比例的减少对培氟沙星与氧氟沙星的分离度影响较大，有机相增加5%，培氟沙星与氧氟沙星的分离度仅为1.17，不能达到基线分离；pH（±0.2）与流速（±20％）的细微变化，不影响各峰的峰形、出峰顺序以及分离情况。不同的色谱柱对紫外及氧化破坏的样品进行了检测，结果出峰时间稍有差异，但主峰与杂质峰分离效果均良好，图谱能较好地重现。
   
　　甲磺酸培氟沙星在波长277 nm和273 nm，峰的响应值没有大的差别，在258 nm波长处，峰的响应值较低，大约为上面两个波长的1/4，经紫外扫描，最大吸收在273 nm处，258 nm为其波谷，各辅料在273 nm波长处几乎无吸收；同时EP6.2［2］上收载的质量标准中，258 nm波长处主要检测培氟沙星主峰以后出峰的杂质，而经前面的破坏试验可知，采用EP6.2流动相系统只有酸破坏样品在主峰后检出一杂质，而其余强破坏样品均未检出杂质峰。另外考虑到含量测定方法和有关物质检测方法的一致性，以便于方法的简便性和可操作性，最终确定检测波长为273 nm。

    本品对光较敏感，因此该品种部分注册标准中要求检测时采用避光操作。经破坏试验显示，本品在强光长时间照射以及紫外光长时间照射，降解速度较快。

【】
  　　［1］国家药典委员会. 中华人民共和国药典（二部）［M］. 北京: 化学出版社, 2005: 130?132.

　　［2］European Pharmacopoeia 6th edition 6.2 ［S］. 2623.