苦参碱对小鼠免疫功能的影响

                 作者：尚智，丁涛，温富春，张伟，张殿文，纪凤兰，徐惠波

【摘要】  目的:观察苦参碱对小鼠脾淋巴细胞增殖和释放白细胞介素-2（IL-2）及腹腔巨噬细胞释放白细胞介素-1（IL-1）的影响。方法:溴化四唑蓝比色法测定脾淋巴细胞增殖，胸腺细胞增殖法和溴化四唑蓝比色法测定IL-1、IL-2活性。结果:苦参碱可明显抑制ConA和LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖及ConA诱导的小鼠脾细胞释放IL-2，对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞释放IL-1亦有一定的抑制作用。结论:苦参碱可抑制体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖和释放IL-2及腹腔巨噬细胞释放IL-1。

【关键词】  苦参碱;免疫功能:淋巴细胞增殖;IL-1;IL-2

　　苦参碱Matrin是豆科槐属植物苦参Sophora fla-vescens Ait.，苦豆子S.AlopecuroidesL，广豆根S.Sub-prostrata Chun et T.Chen等中草药的活性成分。大量报道，苦参碱具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗纤维化、抗心律失常、镇痛、解热、平喘等作用［1、2］。为进一步研究苦参碱的免疫调节作用，本试验观察苦参碱对体外培养小鼠脾淋巴细胞增殖和释放IL-2及腹腔巨噬细胞释放IL-1的影响。

　　1 实验材料
    
　　1.1 动物

　　Balb.c小鼠，6～7周龄，体重20～22g，吉林大学基础医学部实验动物中心提供。

    1.2 药物及试剂

　　苦参碱由吉林省中医中药研究院提供;溴化四唑蓝（MTT）、细菌脂多糖（LPS）、刀豆蛋白A（ConA）为Sigma公司产品;二甲基亚砜（DMSO）广东汕头西陇化工厂产品;RPMI1640培养基，美国GIBCO公司产品;小牛血清（NBS）北京鼎国生物技术中心提供;其余试剂均为分析纯。

    1.3 仪器

　　酶标仪，奥地利TECAN公司产品:CO2 培养箱，日本SANYO公司产品;倒置显微镜，日本OLYMPUS公司产品。

　　2 实验方法
    
　　2.1 苦参碱体外对正常小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响

　　2.1.1 正常小鼠脾淋巴细胞悬液的制备

　　无菌取正常小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用10%NBS-RBMI1640培养液调整细胞浓度5×106 .ml［3］。
   
　　2.1.2 T、B淋巴细胞增殖能力的测定 将5×106 .ml的脾细胞悬液加入96孔培养板中，100μl.孔，然后每孔加入终浓度为5μg.ml的ConA50μl，另一块培养板每孔加入使终浓度为10ug.ml的LPS50μl，然后每孔加入不同浓度的药液50μl，每个浓度设5个复孔，并设空白对照孔和阴性对照孔，将96孔培养板置于37℃5%CO
2 培养箱中培养48h后，每孔加入5mg.ml MTT10μl，继续培养4h，取出96孔板，1000r.min离心5min，弃上清，每孔加入DMSO150μl，置于微量振荡器上振荡10min，酶标仪570nm处测光吸收值A。吸光度大小反映淋巴细胞增殖能力的强弱［4］。
   
　　2.2 苦参碱体外对正常小鼠脾细胞释放IL-2的影响

　　2.2.1 IL-2的粗提 常规方法制备小鼠脾细胞悬液，调细胞浓度5×106 .ml，加入24孔培养板，每孔1ml，再加入终浓度为3μg.ml的ConA0.5ml及不同浓度药液1ml，置37℃5%CO2 培养箱中培养48h，2000r.min离心10min，取上清液，经0.22um微孔滤器过滤，得粗提IL-2的待测品，分装-20℃保存待测。

　　2.2.2 IL-2活性的测定

　　常规法制备小鼠胸腺细胞悬液，加入96孔培养板，每孔50ul，使细胞终浓度为1×105 .ml，再加入终浓度为3μg.ml的ConA50ul及不同稀释度的待测样品100μl，以培养液作为阴性对照，置于37℃5%CO2 培养箱中培养24h后，每孔加入5mg.ml MTT10μl，继续培养4h，取出96孔板，1000r.min离心5min，弃上清，每孔加入DMSO150μl，置于微量振荡器上振荡10min，酶标仪570nm处测光吸收值A。吸光度大小反映IL-2活性的强弱［3］。
   
　　2.3 苦参碱体外对正常小鼠腹腔巨噬细胞释放IL-1的影响
　　2.3.1 IL-1的粗提

　　常规方法制备24孔板巨噬细胞单层，每孔加入终浓度为10ug.ml的LPS0.5ml，以激活巨噬细胞，同时每孔加入不同浓度的试药1ml，培养48h后收获上清，得诱生的IL-1粗品，-20℃保存待测［3］。
   
　　2.3.2 IL-1活性的测定

　　常规法制备107 /ml小鼠胸腺细胞悬液，加入96孔板，每孔0.1ml，同时加入不同稀释度的IL-1待测上清液0.1ml，终浓度为2μg.ml的ConA0.1ml，每个浓度5个复孔，以培养液作为阴性对照，置37℃5%CO2 培养箱中培养68h后，每孔加5mg.ml MTT10μl，继续培养4h，1000r.min离心5min，弃上清，每孔加入DMSO150μl，微量振荡器振荡10min，酶标仪570nm处测吸光度A值。吸光度大小反映IL-1活性的强弱［4、5］ 。
   
　　2.4 统计分析

　　采用SPSS10.0统计软件进行F检验和q检验。统计结果用（ˉx±s）表示。

　　3 结果
    
　　3.1 对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响

　　见表1、表2。表1 体外对ConA非特异性刺激小鼠T淋巴细胞增殖的影响（略）注:与阴性对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。表2 体外对LPS非特异性刺激小鼠B淋巴细胞增殖的影响（略）注:与阴性对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 
　　从表1可见苦参碱在0.5mg.ml、0.25mg.ml和0.05mg.ml3个浓度可明显抑制T淋巴细胞增殖，且呈剂量依赖关系。

     从表2可见苦参碱在4个浓度均可明显抑制T淋巴细胞增殖，且呈剂量依赖关系。
   
　　3.2 体外对正常小鼠脾细胞释放IL-2的影响

　　见表3。 表3 体外对正常小鼠脾细胞释放IL-2的影响（略）注:与阴性对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001  从表3可见苦参碱在0.5mg.ml，0.25mg.ml和0.05mg.ml3个浓度可明显抑制脾细胞释放IL-2，且呈剂量依赖关系。
   
　　3.3 体外对正常小鼠腹腔巨噬细胞释放IL-1的影响

　　见表4。表4 体外对正常小鼠腹腔巨噬细胞细胞释放IL-1的影响（略）注:与阴性对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
    
　　从表4可见苦参碱在0.25mg.ml浓度可明显抑制脾细胞释放IL-2，在其它浓度亦呈抑制趋势，但未见明显差异。
    
　　4 讨论
    
　　近年来，苦参碱作为免疫抑制药物在临床中应用较多，多用于病毒性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病。但对苦参碱免疫抑制作用的体外实验报道较少。淋巴细胞是机体的重要免疫细胞，淋巴细胞转化实验是检测淋巴细胞增殖活性的一种有效的方法，常用于评价药物对机体免疫功能的影响。腹腔巨噬细胞是机体免疫系统的另一重要免疫细胞，是主要的抗原提呈细胞，且具有很强的吞噬功能，在特异性免疫应答的诱导和调节中起关键作用，巨噬细胞可分泌IL-1、IL-6等多种生物活性物质，这些活性物质在机体的免疫调节中起着重要的作用。本研究结果证实苦参碱可抑制小鼠脾淋巴细胞增殖和IL-2的释放，亦可抑制腹腔巨噬细胞释放IL-1，进而起到免疫抑制的作用，抑制自身免疫反应。但其具体的分子生物学机制有待于进一步研究。

【】
  　　［1］王本祥，主编.中药药理与临床［M］.天津:天津科技翻译出版公司，2005，881-885.

［2］刘文雅，刘汉清.苦参碱的药理研究进展［J］.中华实用中西医杂志，2006，19（4）:473-475.

［3］徐叔云，主编.药理实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社，2002，1421-1441.

　　［4］林忠宁，董胜璋.MTT法检测T淋巴细胞增殖功能的方法学探讨与应用［J］.卫生检验杂志，2000，10（1）:8-10.

　　［5］杨贵贞，主编.免疫生物工程纲要与技术［M］.长春:吉林技术出版社，1991，21.