缺血性卒中急性期患者红细胞调控白细胞介素 - 18 新的实验体系研究
【摘要】 目的：采用血液免疫反应路线图实验体系探讨缺血性卒中急性期患者红细胞调控白细胞分泌 IL-18 的能力。方法：将缺血性卒中急性期患者组分为 2 组即大、中小梗死组。将癌细胞（S180）悬液 0.2 mL（10×106/mL）或生理盐水 0.2 mL 加至枸橼酸抗凝全血细胞悬液（或白细胞悬液）0.2 mL 和血浆 0.3 mL 中，37 ℃水浴 1 h，酶联免疫法测定反应 液中 IL-18 含量。结果：大梗死组 IL-18 的含量明显高于中小梗死组和对照组（P < 0.01）。中小梗死组无抗原激活组（0.32±0.34）高于抗原激活组（-0.41±0.74）和对照组无抗原激活组（-0.20±0.50）红细胞对白细胞分泌 IL-18 的调控率（P < 0.05）。结论：动脉粥样硬化阶段就已经存在红细胞免疫功能的下降，梗塞时更为明显。红细胞对白细胞分 泌 IL-18 具有吸附下调作用，疾病严重时处于失调控阶段。
【关键词】 癌；缺血性卒中，急性期；变态反应和免疫学；红细胞；白细胞介素-18
〔Abstract〕 Objective To approach the capacity of erythrocyte regulating IL-18 in patients with acute ischemic stroke (AIS) by a new experimental system of hemaimmune. Methods Patients with AIS were divided into two groups of the large, the midst and small by the volume of infarction and made group comparison. 0. 2 mL suspension of cancer cells (S180:10 ×106/mL) or NS were added into 0.2 mL anticoagulant suspension of whole blood cells or leukocytes and 0.3 mL plasma, then incubated for 1 h at 37℃. The content of IL-18 was determined by ELISA. Results The content of IL-18 in the large group was much higher than those of the others. The regulative capacity of erythtocyte to IL-18 with cancer cells was lower than without in the midst and small group, and also was lower than that of the control group with cancer cells. Conclusion When in the period of atherosclerotic, the immunity erythrocyte had been declined. And it declined more when in AIS. It could absorb IL-18, while it was in imbalance when the disease was serious.
〔Key Words〕 Carcinoma; Ischemic stroke; Acute; Allergy and immunology; Erythrocytes; Interleukin-18
IL-18 作为一种新近发现的促炎细胞因子，机体的众多器官、组织和细胞都可检测到 IL-I8 mRNA 的存在，外周血单核细胞经内毒素（LPS）刺激也有表达。在神经系统中，小胶质细胞[1]、星型胶质细胞[2]、神经元和室管膜细胞[3]也可产生。IL-18 能够有力地激活 T 细胞和巨噬细胞，产生一系列细胞因子。研究表明，IL-18 参与动脉粥样硬化和缺血性脑卒中的病理过程。
本实验采用“血液免疫反应路线图”[4]理论构建的与分离的实验体系，测定缺血性卒中急性期红细胞调控白细胞分泌 IL-18 的水平，证实癌细胞可以激活白细胞分泌 IL-18，红细胞可以吸附白细胞分泌的 IL-18，同时也证明了缺血性卒中急性期红细胞免疫功能低下，对白细胞分泌 IL-18 调控的能力处于失平衡状态。
1 材料与方法
1.1 研究对象
缺血性卒中急性期患者 11 例新鲜枸橼酸抗凝血标本，其中男 8 例，女 3 例，年龄 40~66 岁，平均（52.0±5.8）岁，诊断均符合 1995 年全国第 4 届脑血管病会议制定的标准，且均在入院后 3 d 内行头颅 CT 或 MRI 检查证实。按 Pullicino 公式脑梗死体积，即：脑梗死体积（cm3）= 长×宽×CT 扫描阳性层面数×π/6。按脑梗死灶体积大小将病例分为中小梗死灶组（1.6~8.0 cm3，n = 8）和大梗死灶组（> 8 cm3，n = 3）。伴有自身免疫性疾病、恶性肿瘤、感染或正在服用激素、体温超过 37.5℃及严重心、肝、肾疾病或 3 个月内有脑卒中史者均排除在外。对照组为存在卒中危险因素但未发生卒中的亚健康者：其中男 5 例，女 2 例，年龄 40~64 岁，平均（51.0±6.0）岁。所有入选病例均行颈动脉超声检查，3 组患者在动脉硬化程度以及年龄上相匹配，无显著统计学差异（P > 0.05）。
1.2 材料
IL-18 酶联免疫试剂盒（法国 Diaclone 公司，批号：H0182710），癌细胞冰冻试剂（S180 株，浓度为 5×106/mL，长海输血科血液免疫研究室制备）。
1.3 方法
1.3.1 癌细胞 S180 激活全血细胞和白细胞分泌IL-18 测定法 癌细胞 S180 用生理盐水配成 10×106/mL。抗凝血水平离心分离血浆，放另一试管备用。沉淀血细胞用生理盐水沉淀洗涤 1 次并恢复原体积为全血细胞悬液混匀备用。正式试验；第 1 试管（试管 1）加 0.2 mL 全血细胞，加 0.2 mL 癌细胞悬液，再加 0.3 mL 血浆，为癌细胞激活全血实验组（NEG）。第 2 试管（试管 2）加 0.2 mL 全血细胞，加 0.2 mL 生理盐水，再加 0.3 mL 血浆，为全血细胞生理盐水组（NCG）。
再取两支试管（10 mL 规格试管）分别加入 0.2 mL 全血细胞悬液，用 1~2 mL 蒸馏水在冰水中轻轻吹打 1 min 破坏红细胞后再加等量的高渗盐水恢复等渗，再加生理盐水至满，轻轻吹打洗涤，离心后倒尽上清液，第 1 试管（试管 3）加 0.2 mL 全血细胞和 0.3 mL 血浆，为癌细胞激活白细胞组（IEG）。第 2 试管（试管 4）加 0.2 mL 生理盐水，再加 0.3 mL 血浆，为白细胞生理盐水组（ICG）。试管1、2、3 和 4 分别混匀后 37℃水浴 1 h 后，离心，取上清液，置于 - 200℃冰箱冻存。用酶联免疫法测定反应液中 IL-18 含量，按公式算出各自标本红细胞 IL-18 调控率（%）=〔IEG 中 IL-18 含量（或 ICG 中 IL-18 含量）- NEG 中 IL-18 含量（或 NCG 中IL-18 含量）〕/ IEG 中 IL-18 含量（或 ICG 中 IL-18 含量）。红细胞对 IL-18 的激活指数（%）=〔IEG 中 IL-18 含量（或 NEG 中 IL-18 含量）- ICG 中 IL-18 含量（或 NCG 中 IL-18 含量）〕/ IEG 中 IL-18 含量（或 NCG 中 IL-18 含量）。
1.4 统计学处理
数据结果以 x±s 表示，组间比较采用 t 检验。
2 结 果
2.1 病例组中大梗死组各项指标结果与中小梗死组及对照组 IL-18 各项指标结果
见图 1。大梗死组中各组指标均明显高于相应中小梗死组及对照组的 IL-18 含量（P < 0.001）。且中小梗死组也均高于对照组相应各组数据，但无统计意义。
2.2 癌细胞 S180 激活红细胞增强白细胞分泌 IL-18 测定结果自然与分离体系比较
见图 1。在全血细胞免疫反应中，病例组和对照组均是 NEG 明显高于 NCG。在白细胞免疫反应中，除中小梗死组 IEG（此组标准差比较大，考虑可能系样本量比较小的缘故）低于 ICG 外，其余也均是 IEG 高于 ICG。
说明：①大梗死组 NCG 与中小梗死组及对照组 NCG 比较，P < 0.01；②大梗死组 NEG 与中小梗死组及对照组 NEG 比较，P < 0.01；③大梗死组 IEG 与中小梗死组及对照组 IEG 比较，P < 0.01；④大梗死组 ICG 与中小梗死组及对照组 ICG 比较，P < 0.01。
2.3 癌细胞 S180 激活全血实验组和白细胞组 IL-18 测定结果比较
见图 1。在病例组中小梗死组和对照组均是 NEG 高于 IEG 中 IL-18 水平，但在病例组的大梗死组却出现相反的情况，但是，在更为大面积梗死组中，是否也存在此种逻辑，还有待于扩大进一步研究。
2.4 NCG 和 ICG 组 IL-18 测定结果比较
见图 1。在病例组大梗死组中 NCG 中 IL-18 测定结果低于 ICG，但在中小梗死组中 ICG 反而高于 NCG，在对照组中，两者几乎相等。
2.5 病例组和对照组红细胞对白细胞分泌 IL-18 调控率结果比较
见图 2。对照组和病例组，无抗原时，均是白细胞组对 IL-18 的调控率高于或几乎等于全血细胞组（其中对照组为 - 0.20±0.50，接近于 0），而在加用抗原刺激的情况下，情况相反，但大梗死组仍如此。
说明：①中小梗死组存在癌细胞情况下与无癌细胞下调控率比较，P < 0.05；②中小梗死组无癌细胞情况下与对照组有癌细胞情况下比较，P < 0.05。
2.6 病例组和对照组癌细胞对白细胞分泌 IL-18 激活指数结果比较
病例组的中小梗死组和对照组，都是全血细胞组高于白细胞组，但大面积梗死组，情况相反，但无统计学意义。
3 讨 论
1981 年美国生殖免疫学家 Siegel 提出了红细胞免疫系统的概念。2005 年国内郭峰提出“红细胞天然免疫主干道理论”，并构建了快速简便的“和分离实验体系”的实验研究方法。
本实验研究表明，白细胞分泌 IL-18 的水平与梗死面积相关，即：梗死面积越大，则 IL-18 水平亦越高。这与 Zaremba 等[5]报道一致，即：缺血性脑中风患者发病 24 h 内血清 IL-18 含量与患者的脑 CT 的低密度值等呈显著的正相关性。癌细胞 S180 激活红细胞增强白细胞分泌 IL-18 是一种快速天然免疫反应，自然与分离体系的结果表明，灭活的癌细胞是一种抗原细胞，能够在体外仿真实验研究体系，本次实验表明，癌细胞可快速激活外周血单核细胞天然免疫反应，NCG 中 IL-18 水平相对最低，说明红细胞可以吸附下调白细胞天然免疫反应分泌的 IL-18。对照组中 NCG 与 ICG 中 IL-18 水平基本相同，说明，动脉粥样硬化患者红细胞免疫调控 IL-18 的功能下降。从红细胞对白细胞分泌 IL-18 调控率分析，无抗原存在的情况下，由于红细胞可以吸附下调白细胞分泌 IL-18，使之维持在较低水平，从而阻止炎症反应的继续。但在对照组即动脉粥样硬化患者中，由于红细胞免疫功能已下降，因此癌细胞S180 激活组，此时红细胞免疫功能下降更为明显，故其吸附白细胞分泌 IL-18 的水平明显下降，在中小梗死组的病例组中情况类似，但大梗死组却出现了相反情况，表明此时红细胞免疫功能失衡，即对白细胞分泌 IL-18 处于失调控状态，导致血液循环中 IL-18 正增长，而 IL-18 又可刺激 TH1 细胞泌多种细胞因子[6]，从而形成恶性循环，产生毒性产物，进一步加重炎性反应。从红细胞增强抗原激活白细胞分泌 IL-18 水平来看，大面积梗死组的激活指数明显低于其他两组，也同样说明此时红细胞免疫功能失平衡。因此，如果在缺血性卒中急性期采取某种措施提高红细胞的免疫功能，那么红细胞调控吸附 IL-18 的能力就会明显上升，从而阻止炎症反应的进一步进行。
本实验说明用系统免疫学的理论与方法去研究系统血液天然免疫反应的机理是非常简单有效的。新的实验研究方法证明，缺血性卒中急性期 IL-18 含量高与红细胞天然免疫调控白细胞功能紊乱有关，说明红细胞参与了缺血性卒中急性期炎症反应过程，其复杂的机理值得积累资料进行进一步深入研究。
【】
〔1〕Suk K, Yeou-Kim S, Kim H. Regulation of IL-18 production by IFN gamma and PGE2 in mouse microglial cells:involvement of NF-kB pathway in the regulatory processes〔J〕. Immunol Lett, 2001, 77(2):79-85
〔2〕Conti B, Park LC, Calingasan NY, et al. Cultures of astrocytes and microglia express interleukin 18〔J〕. Brain Res Mol Brain Res, 1999, 67:46-52
〔3〕Sugama S, Cho BP, Baker H, et al. Neurons of the superior nucleus of the medial habenula and ependymal cells express IL-18 in rat CNS〔J〕. Brain Res, 1999, 958:1-9
〔4〕郭峰, 张乐之, 花美仙, 等. 癌细胞激活血液免疫反应路线图初步研究〔J〕. 肿瘤学杂志, 2005, 11(3):163-166
〔5〕Zaremba J, Losy J. Interleukin-18 in acute ischemic stroke patients e〔J〕. Neurol Sci, 2003, 24(3):117-124
〔6〕刘利群, 毛定安. IL-18与中枢神经系统疾病〔J〕. 国外医学·生理、病理与临床分册, 2005, 25(1):68-70
