中药对骨质疏松大鼠骨骼肌形态学的影响

【摘要】  目的：研究中药对骨质疏松大鼠骨骼肌形态学指标的影响。方法：SD 雌性大鼠去势后，分为正常对照组（SHAM）、去卵巢手术组（OVX）、雌激素组(OVX+ES)、中药组（OVX+TCD），SHAM 组、OVX 组予蒸馏水，OVX+ TCD 予骨康灌胃给药，OVX+ES 组给予尼尔雌醇灌胃，正常对照组给予蒸馏水灌胃。 3 个月后取左侧骨直肌检测。 结果：各指标中，去卵巢对照组与正常组比较均有显著差异（P < 0.01），表明骨质疏松大鼠模型的骨骼肌存在着较明显的退变。激素组能明显增粗骨骼肌纤维（P < 0.01），中药组次之（P < 0.05），且中药组与激素组比较无显著差异；激素组能使骨骼肌横截面积及骨骼肌纤维周长明显增加（P < 0.01），中药组次之（P < 0.05）；且中药组与激素组均能明 显减少单位面积骨骼纤维数目（P < 0.01）。结论：中药骨康能够提高骨骼肌纤维横截面积、周长，但其作用较雌激素弱。

【关键词】  骨质疏松；中药；骨骼；肌形态学；大鼠

    骨折是骨质疏松症最为常见的继发疾病，骨折后对运动能力、一般健康水平、社会行为能力、精神状态等都有显著的影响，甚至危及到生命。目前关于骨质疏松性骨折的研究中，除了认为骨质量降低是骨折发生的主要原因外，骨骼肌的退变也逐渐被人们所认识，在此次研究中我们观察了中药骨康对骨质疏松大鼠骨骼肌的作用，观测肌形态学相关指标，探讨中药在治疗骨质疏松症过程中的多重作用。

    1    材料与方法

    1.1    药物及试剂    中药骨康由淫羊藿、补骨脂、丹参、黄芪等 10 味中药组成，其提取液含生药量 1.43 g/mL，由广州中医药大学附属骨伤科制剂室提供；尼尔雌醇片由上海华联制药有限公司生产，批号：060702。

    1.2    动物及分组    选用 6 月龄健康雌性 Sprague -Dawley（SD）大鼠 58 只，体重 260~290 g，清洁级，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：2003A010。随机抽取 10 只作动物模型监测，剩余 48 只随机分为 4 组，分别为正常对照组（SHAM）、去卵巢手术组（OVX）、雌激素对照组（OVX+ES）、中药组（OVX+TCD）。所有大鼠均在广州中医药大学动物中心清洁级动物实验室分笼饲养，相对湿度 40%~70%，温度 18~29℃，空气洁净度 100 000 级，菌落数≤12.2 个/皿，噪音≤60 dB，昼夜明暗交替时间 12/12 h。自由进食标准饲料和饮用水。

    1.3    动物模型制备    按去卵巢骨质疏松动物模型要求进行手术动物模型的制备[1]。用 10% 水合氯醛溶液按 0.33 mL/100 g 腹腔注射麻醉，俯卧位固定，在背部中 1/3 处剪毛，自腰椎背部中线向下作纵行切口长 2~3 cm，沿肩胛线分别于两侧肋下剪开腰肌，可见位于肾脏外下方的卵巢及与其相连的子宫角，对 10 只抽检大鼠和 OVX 组、OVX+ES 组、OVX+TCD 组的大鼠均行手术结扎并切断子宫角，完整切除双侧卵巢，切口缝合，完成手术造模；SHAM 组大鼠行假手术，采用同样的麻醉和手术入路，找到卵巢后，切除卵巢附近的部分脂肪后即关闭。切除的组织交专人检查以确保组织的完整性，并通过组织学检测确实组织的正确性。术后所有大鼠按 1.6 万 U/100 g 肌肉注射青霉素，每天 1 次，连续 3 d，防止术后感染。手术前、术后 3 月对抽检大鼠分别采用 DXA 进行全身骨密度测定，用于证实本次实验大鼠在切除卵巢术后 3 个月出现了骨质疏松的改变，造模成功。

    1.4    治疗方法    手术后正常饲养 3 月后开始治疗，治疗时间为 3 个月。SHAM 组、OVX 组以蒸馏水 10 mL/kg 灌胃，1 次/d；OVX+TCD 组按 4.8 g/kg 骨康（相当于临床剂量的 10 倍），灌胃给药，每天 1 次；OVX+ES 组给予尼尔雌醇 1 mg/kg 灌胃，使用前配成混悬液（浓度为 0.167 mg/mL），1 次/周，正常对照组每天给予蒸馏水 10 mL/kg 灌胃。

    1.5    取材方法    实验过程中 SHAM 组 12 号、OVX+TCD 组 8 号在进行活体骨密度检查时因麻醉过深死亡。剩余动物采用断头处死的方法，在治疗后 3 个月后全部处死。处死后取左侧股直肌称量湿重后，分别放入 10% 中性福尔马林磷酸缓冲液中固定待行组织学检测。

    1.6    实验指标测试方法

    断头处死大鼠，取出左侧股直肌分别用天平称量湿重后，再放入 10% 中性福尔马林磷酸缓冲液中固定 24 h，用 70%~100% 各级酒精脱水，二甲苯透明两次，浸蜡，石蜡包埋、切片（片厚约 5   m）、HE 染色，封固好的切片置于 20×20 倍镜下观察骨骼肌组织形态变化[2，3]并照取图像，经由 Image Pro Plus 5.0 软件测量骨骼肌纤维平均直径、平均面积、周长及单位面积下骨骼肌纤维数量（由于均采用了 400×图像，具备同样放大率及标尺，其数值结果即能进行比较分析，所以未进行实际单位换算）。

    1.7    统计方法    全部计量资料采用 x±s 表示，统计处理软件系统采用 SPSS 10.0。数据组间比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），造模手术前后数据采用自身配对 T 检验，两种数据的相关性采用相关性分析。

    2    结    果

    2.1    各组大鼠骨骼肌的变化    肉眼检查：各组大鼠股直肌大小、形状均正常，外膜光滑，未见渗出物，表面及切面未见出血点及坏死灶。镜下观察：各组肌组织排列结构未见异常，间质未见明显炎性细胞浸润和血管增生。

    2.2    各组大鼠骨骼肌形态学指标比较    如表 1、图 1 所示，各指标中，去卵巢对照组与正常组比较均有显著差异（P < 0.01），表明骨质疏松大鼠模型的骨骼肌存在着较明显的退变。在改善去卵巢大鼠骨骼肌纤维直径方面，激素对照组能明显增粗骨骼肌纤维（P < 0.01），中药组次之（P < 0.05），且中药组与激素对照组比较无显著差异；在改善去卵巢大鼠骨骼肌横截面积和骨骼肌纤维周长方面，激素对照组能使骨骼肌横截面积及骨骼肌纤维周长明显增加（P < 0.01），中药组次之（P < 0.05）；在减少单位面积骨骼肌纤维的数目方面，中药组与激素对照组均能明显减少其数目（P < 0.01）。

    结果表明：中药能够在一定程度上改善骨骼肌的素质，但在本研究中，其能力较雌激素弱。

    3    讨    论

    如果不考虑性别、年龄和身高，局部肌肉强度是决定整个骨骼强度的重要因素[4]。在日常生活中骨骼最大的载荷来自肌肉的主动收缩，研究显示肌肉强度和肌肉含量与其附着骨骼的骨量呈正相关[2]。Frost[3] 认为，肌力决定骨结构和骨量。张林提出[5]肌肉强度和骨强度具有紧密相关性，二者之间的比值处于恒定值，因此，如何保持肌肉强度，对控制后天的骨强度和骨量是十分重要的。童普德[6]提出：作为一个完整的运动功能单位，骨与肌肉是紧密联系在一起的，肌力、肌组织质量和 BMD 之间显著相关，通过肌肉的收缩对骨产生应力负荷，也是骨质疏松症的有效方法。另外，肌肉强度增加的同时，不仅改善了病人的平衡能力、动作的敏捷度，从而预防跌倒，还能够为骨骼系统提供强有力的动力系统，防止骨关节系统的有害运动，在 Anna[7] 的研究中就提到，背肌肌力的增强，对老年妇女的驼背畸形有着明显的预防作用，说明在维持脊柱的正常结构中有着非常重要的作用。骨骼肌衰弱是老年人常见的增龄性病症。许多学者从不同角度探索了老年性骨骼肌衰弱的发病机理。绝大多数研究证实了增龄对老年人骨骼肌的运动单位募集水平、结构及代谢功能都产生很大的影响 。肌纤维蛋白的含量可以在一定程度反映肌纤维面积和肌肉力量，肌肉的抗氧化能力可反映出肌肉的衰老程度。形态学方面研究指出，老年人骨骼肌肌力下降与肌肉体积萎缩正相关。肌肉的组织学检查能对肌肉的形状、功能状态作一基本了解。

    本研究中，大鼠切除卵巢后，相对于未切除卵巢的大鼠，骨骼肌在组织形态学上发生了改变，主要表现在骨骼肌纤维直径、横截面积、周长上的缩小，同时在单位面积上骨骼肌的数量是增大的，这些结果表明，大鼠经去势后，骨骼肌存在着明显的萎缩现象，这样的变化最终导致的结果是骨骼肌力量、耐力等的降低，削弱了肌系统的运动能力。而经过激素及中药治疗后，各项指标均有显著的提升，其效果以激素最为显著，中药稍弱。其中骨骼肌纤维的直径、横截面积和周长的增高趋势一致，均是按激素、中药、正常、去卵巢这样一个顺序递增，且激素、中药与正常组间均存在差异；而单位横截面积上的骨骼肌纤维数量上虽然也存在同样趋势，但激素组与中药组间未见明显差异，这可能是因为我们只观测了骨骼肌纤维的各项参数，而肌纤维间组织在图像分析中具有一定的干扰作用有关。

    在绝经后髋部骨质疏松性骨折的风险研究中，有人提出：进行绝经后妇女髋部骨折风险的综合预测时，必须同时考虑骨内因素与骨外因素，骨内因素主要指骨的量和质，而骨外因素主要是肌肉的状况。肌肉无论是在参与神经肌肉功能发挥身体平衡与姿势协调，还是参与摔倒力学中的能量吸收与保护性反应的过程中，都占有不可替代的地位[8]。所以保持肌肉质量和功能的正常对骨质疏松患者具有重要意义。药理研究发现，淫羊藿、补骨脂等补肾中药含有黄酮类物质，具有植物雌激素的作用特点，其中异黄酮具有控制雌激素受体的作用，既可表现较弱的雌激素作用，也可呈现雌激素拮抗剂的特点，并有种属的特异性[9]。异黄酮作为较弱的雌激素激动剂或拮抗剂，可以抑制破骨细胞的活性，增强成骨细胞的活性，维持成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡，有效地预防和治疗骨质疏松，又可避免或减少对机体带来其他的副作用。

    本实验结果表明，中药能够在改善肌肉形态学方面，有一定作用，从而证明中药能够改善肌素质，但较雌激素弱。所以我们认为，中药能够在治疗骨质疏松症的同时，增强肌系统的素质，从而预防骨折发生，并减少运动损伤。但仍需深入研究，寻找更为安全有效的，在能够治疗骨质疏松症的同时，又对肌系统具有较强作用的组方。

【】
  〔1〕邹移海, 黄韧, 连至诚, 等. 中医实验动物学〔M〕. 广州:暨南大学出版社, 1999. 128

〔2〕Lanyon LE. Using functional loading to influence bone mass and architecture: objectives, mechanisms, and relationship with estrogen of the mechaically adaptive process in bone〔J〕. Bone, 1996, 18:S37-S43

〔3〕Frost RM. Perspectives on our age-ralated bone mass: insights from a new paradigm〔J〕. J Bone Miner Res, 1997, 12: 1539-1546

〔4〕杨欣, 刘忠厚. 骨强度在骨质疏松诊断中的作用〔J〕. 骨质疏松杂志, 2003, 9(3):279-282

〔5〕张林. 运动对骨力学性能的影响——骨生物力学研究进展〔J〕. 中国运动医学杂志, 2002, 21(1):85-88

〔6〕童普徳, 石印玉, 吴小江, 等. 补肾益精方对卵巢切除大鼠股四头肌球蛋白重链基因mRNA表达的影响〔J〕. 中国中医骨伤科杂志, 2001, 9(4):1-4

〔7〕Anna Mika, Viswanath B. Unnithan, differences in thoracic kyphosis and in back muscle strength in women with bone loss due to osteoporosis〔J〕. Spine, 2005, 30(2): 241-246

〔8〕张戈, 石印玉, 秦岭, 等. 绝经后髋部骨质疏松性骨折风险的研究进展〔J〕. 中国中医骨伤科杂志, 2003, 11(1):49-51

〔9〕Setchell K. Phytoestrogens: The biochemistry, physiology, and implications for human health of soy is isoflavones〔J〕. Am J Clin Nutr, 1998, 68(Suppl):1333s-1346s